长链非编码RNA-NR_024158在肾肿瘤中的表达及其对肾肿瘤细胞增殖和迁移的影响

潘炜 蔡鹤龄 吴运 韩灵骏 方继超 李文成

肾肿瘤发病率居泌尿系肿瘤第三位，每年有超过二十万新发病例和十万死亡病例[1-2]。肾肿瘤病理类型中绝大多数为肾透明细胞癌，约占四分之三[3-4]。目前，肾肿瘤的治疗以手术切除为主，包括肾根治性切除和保留肾单位的肾部分切除术等[5-6]。晚期肾肿瘤患者可以考虑靶向药物治疗，早期患者在一定条件下也可以考虑靶向药物治疗以预防肿瘤复发[7-9]。然而，有些患者经手术或靶向治疗后效果并不理想，严重影响着患者的身心健康，进一步研究肾肿瘤的发生、发展机制进而指导临床实践就显得非常迫切。长链非编码RNA作为基因中占比非常大的一部分非编码序列，曾经被认为是无用序列，不参与生命活动进程。近些年研究发现，长链非编码RNA几乎参与了所有的病理生理过程，并有时间和空间特异性，可以通过多种作用机制影响相对应的基因的表达进而引起多种表型变化[10-12]。NR_024158作为一种新型长链非编码RNA，研究发现其在肾肿瘤细胞中表达减低[13]，定位于5号染色体上，转录长度为1 760 nt，基因编号为LOC25845。本研究主要探讨NR_024158在肾肿瘤组织和细胞系中的表达及其调控机制，并分析其在肾肿瘤中的可能功用，初步阐明NR_024158在肾肿瘤发生、发展中的作用。

材料与方法

一、材料、试剂

随机选取9例肾肿瘤标本(术后病理：高分化透明细胞癌2级，TNM分期T1～T2期)，标本均来源于华中科技大学附属协和医院泌尿外科实施的腹腔镜根治性肾切除手术，标本获取后将其置于液氮或-80 ℃冰箱冷藏备用。肾癌细胞系ACHN、786O、769P、Caki-1及对照细胞系HK-2(购自上海酶研生物科技有限公司)，胎牛血清和基础培养液(购自hyclone公司)，实时定量PCR相对试剂盒(购自日本Takara公司)，慢病毒相关服务(由吉凯公司提供)，转染试剂(购自美国Invitrogen公司)，去甲基化药物(5-Aza.dc，购自sigma公司)，其他相关试剂及耗材(购自武汉博士德公司)。

二、病毒包装及感染

准备好生物安全柜操作台及慢病毒包装试剂盒pPACKH1TMLenti-vector Packaging Kit(慢病毒包装载体)，将目的基因NR_024158构建至pCDH Lenti-vector上，感染后观察72 h，根据细胞GFP的表达量和感染效率决定是否进行下一步实验。剩余病毒妥善保管，留做备用。

三、肾癌细胞系的去甲基化药物处理

ACHN、786O、769P、Caki-1细胞系用经纯水溶解后的2 mg 5-Aza.dc过滤去菌，将5-Aza.dc终浓度调配至10 μmol/L，各细胞系密度大约在90%左右，且培养过程中每天更换新鲜的药物培养液，共培养3 d，进行后续实验。

四、逆转录实时定量PCR

利用trizol提取细胞和组织总RNA。取500万细胞以1 ml trizol充分裂解15 min，再加入0.2 ml氯甲烷剧烈震荡15 s，静置后于低温离心机12 000 g离心15 min；将0.5 ml异丙醇加入于上一步骤移出的上清液中并摇匀，10 min后于4 ℃离心机12 000 g离心10 min，弃上清，加入预冷的1 ml 75%乙醇洗涤沉淀后于4 ℃离心机7 500 g离心5 min，弃上清。室温放置约10 min挥发多余水和乙醇，注意避免完全干燥，加入50 μl无RNase水溶解RNA，测浓度和纯度后备用。后续PCR反应根据试剂盒提供的反应体系进行处理，反应条件如下：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s以及72 ℃延伸30 s，于Mx3000p实时定量PCR系统进行PCR进程，设计循环为35个。本实验实时定量PCR引物：F：GCCTTCCAAGTGCCTGTCTGT；R：CCGTGTTTGTGTTTAGCCTGTG；甲基化特异性PCR引物：Left M primer：GGGGTTTAATTAGAAT-AAGAAGGC；Right M primer：ACTATTTCTCTACGAAACAAACGTA；Left U primer：GGG-GTTTAATTAGAATAAGAAGGTG；Right U primer：ACTATTTCTCTACAAAACAAACATA。

五、增殖实验

根据实验要求将不同组别细胞分别种植于96孔板中，设计4个复孔，细胞数量在2 000个左右；待细胞贴壁后用无血清培养液和MTS按照10∶1的比例配制MTS培养液混合液，充分混合后每孔加入100 μl，放入培养箱中培养2 h后酶标仪测定吸光度。

六、迁移、侵袭实验

在每个小室中用无血清培养液种植105数量级细胞，侵袭实验需先用基质胶对小室进行预处理；培养12～18 h后收集小室进行甲醇固定，15 min后用0.5%结晶紫染色15 min，固定结束后PBS洗涤干净，用棉签擦拭去未有迁移或侵袭细胞后显微镜观察结果并记录分析，重复3遍。

七、统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据处理。两组之间的比较整体数据符合正态分布的选用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、NR_024158在肾肿瘤组织和细胞系中的表达减低

逆转录实时定量PCR结果显示，9例肾肿瘤标本(T)中NR_024158的表达较对照细胞系HK-2(N)减低，其中8例肾肿瘤组织中NR_024158的表达减低超过50%，和对照细胞系HK-2比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1 A。相对于对照细胞系HK-2，769P中NR_024158的表达减低最多，达90%以上，其次是ACHN细胞，达80%，而786O和Caki-1的下降相对少一点，分别约70%和60%，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1B。NR_024158在肾肿瘤组织和细胞系中均呈低表达状态。

A：肾肿瘤组织；B：肾癌细胞系图1 NR_024158在肾肿瘤组织和细胞系中的相对表达量

二、NR_024158在肾肿瘤中的表达受甲基化调控

逆转录实时定量PCR检测结果显示，5-Aza.dc处理后，肾肿瘤细胞系ACHN、786O、769P和Caki-1中NR_024158的表达均有不同程度的提升，其中786O提升程度最大，其次分别是ACHN、Caki-1和769P，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2 A。甲基化特异性PCR检测结果显示，ACHN、769P和肾肿瘤组织中均可以检测到NR_024158启动子区的甲基化状态。见图2 B。说明在肾肿瘤组织和细胞系中NR_024158的表达减低受甲基化调节或者是部分受甲基化调节。

A：肾肿瘤细胞系去甲基化药物处理后NR_024158的表达；B：肾肿瘤细胞系ACHN、769P和3对肾肿瘤组织中甲基化特异性引物组的扩增图2 肾肿瘤细胞系和组织中NR_024158的甲基化调控分析

三、NR_024158抑制肾肿瘤细胞的增殖和迁移、侵袭，在肾肿瘤中发挥抑癌基因样作用

在功能分析之前，进行目标基因慢病毒转染效率验证，慢病毒转染肾肿瘤细胞4 d后进行PCR检测，发现NR_024158的表达明显上升，在ACHN和769P细胞中分别达到了16.85倍和21.59倍，完全达到了后续功能实验的要求(要求表达提升1倍)，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3 A。酶标仪检测感染了Lenti-NR_024158的肾肿瘤细胞ACHN和769P 4个时间点的增殖情况，发现过表达NR_024158后，ACHN和769P的增殖能力较未表达NR_024158前受到明显的抑制，到第4个时间点的抑制率分别达到了43.56%和35.49%，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3 B。过表达NR_024158后，相对于对应的阴性细胞对照组，ACHN细胞中迁移细胞减少了52%，侵袭细胞减少了58%；769P细胞中迁移细胞减少了42%，侵袭细胞减少了62%，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3 C。NR_024158抑制肾肿瘤细胞的增殖和迁移、侵袭，在肾肿瘤中发挥抑癌基因样作用。

A：目标基因慢病毒感染效率；B：增殖实验；C：迁移和侵袭实验图3 目标基因的感染效率验证及其在肾肿瘤中的增殖和迁移作用分析

讨 论

肾肿瘤是泌尿系的主要肿瘤之一，严重影响着患者的身心健康，积极寻找更加有效的防治措施显得尤为重要。长链非编码RNA作为体内重要的非编码RNA，近些年来越来越受到关注，多项研究表明其在人类病理生理过程中发挥着重要的调节功能，在肾肿瘤发生、发展中的作用包括作为内源性竞争性RNA竞争结合相应小分子RNA从而影响重要靶标基因的表达，以及其他相关机制影响肾肿瘤进程[14-16]。根据NR_024158在肾肿瘤中表达减低的相关报道，本研究应用逆转录实时定量PCR对临床肾肿瘤组织标本和肾肿瘤细胞系中NR_024158的表达水平进行了验证，结果发现NR_024158在肾肿瘤细胞系和组织中普遍表达减低，说明NR_024158可能在肾肿瘤的发生、发展过程中发挥重要的调节功能。其后我们研究了NR_024158表达减低的可能机制，着眼于表观遗传学研究，发现肾肿瘤细胞系在经过去甲基化药物5 Aza.dc处理后，NR_024158的表达明显上升，同时应用甲基化特异性PCR检测肾肿瘤组织和细胞系NR_024158启动子区甲基化状态，发现甲基化特异性引物在体系中可以扩增出相应产物，说明NR_024158的表达减低受启动子甲基化调节，或者是部分受到甲基化调节。最后，通过慢病毒包装感染肾肿瘤细胞系建立稳定表达NR_024158的细胞系进行功能实验，发现稳定转染了NR_024158的细胞系与相对应的阴性对照细胞相比，其增殖和迁移、侵袭能力受到了明显的抑制，说明在肾肿瘤中NR_024158的过表达可以明显抑制肿瘤的恶性生物学行为。

综上所述，NR_024158在肾肿瘤中的低表达受甲基化调节，同时NR_024158在肾肿瘤中起着抑癌基因样作用，参与了肾肿瘤的发生、发展。