黏附因子VSIG1在膀胱尿路上皮癌中的表达及其意义

刘陈黎 廖锦先 李茂章 周晓波 陈佳

膀胱癌是泌尿系统中最为常见的一种恶性肿瘤。尽管我国膀胱癌发病率远低于西方国家，但也是居高不下，男性膀胱癌发病率位居全身恶性肿瘤的第七位，女性排在第十位以后[1]。由于我国各个地区医疗水平的不平衡，许多患者就诊时肿瘤已进展为中晚期，因此寻找膀胱癌早期诊断和预后指标十分迫切。紧密连接在保持尿路上皮细胞间细胞极性和信号转导途径中扮演着重要的角色[2]。VSIG1(V-set and immunoglobulin domain containing 1)是紧密连接黏附分子家族成员之一，研究发现，VSIG1在正常胃黏膜及睾丸生殖细胞呈高表达，而在胃癌、食管癌等肿瘤组织中的表达明显下降[3]。本研究采用Western blot及免疫组织化学法对膀胱尿路上皮癌中VSIG1蛋白的表达进行了检测，发现VSIG1基因与膀胱尿路上皮癌的发生和发展具有一定相关性。现报告如下。

对象与方法

一、一般资料

2015年1月至2017年6月于我院接受膀胱根治性切除且临床及病理资料完整的50例膀胱肿瘤患者纳入研究。50例中男41例、女9例。年龄51～73岁，平均年龄(64.3±5.7)岁。按照WHO尿路肿瘤组织学分类法进行分类，50例中肌层浸润性尿路上皮癌32例、非肌层浸润性乳头状尿路上皮癌18例(其中高级别13例、低级别5例)。初发肿瘤34例、复发肿瘤16例。

二、方法

1.Western blot方法检测组织中VSIG1蛋白的表达：①取相同质量大小的冷冻组织(尿路上皮肿瘤组织及距离肿瘤边缘3～5 cm的正常膀胱黏膜组织)，将RIPA裂解液加入组织中裂解，然后12 000 rmp 4 ℃离心30 min后收集裂解液；②将20 μg蛋白样本加入12% SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；③将凝胶内蛋白转膜至PVDF膜；④将PVDF膜置入5%脱脂牛奶封闭非特异性结合位点1 h；⑤一抗(山羊抗人VSIG1抗体，1∶1 000，R&D Systems)4 ℃过夜孵育PVDF膜；⑥PBST洗涤4遍，辣根过氧化物酶结合的兔抗山羊lgG抗体(1∶2 000，Proteintech Group)37 ℃孵育PVDF膜60 min，特异性探针检测结合位点；⑦PBST洗涤4遍，将增强化学发光反应物加至蛋白条带，条带密度通过Image J软件进行计算。采用GAPDH蛋白作为内参(一抗小鼠抗人GAPDH单克隆抗体，Abcam公司)共检测了20对膀胱尿路上皮癌及癌旁组织。

2.免疫组织化学法检测VSIG1基因的表达：对5 μm的组织切片进行常规脱蜡至水，在0.01 mol/L加热沸腾的柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中漂洗3×3 min使抗原修复，于室温下自然冷却，在PBS下进行3×5 min的漂洗，并在漂洗完成后滴入3%的过氧化氢，室温下孵育10 min，同时在0.01 mol/L的PBS中漂洗3×5 min，在非免疫血清的湿盒中室温下孵育30 min，并去除多余的血清(勿洗)，加入一抗(山羊抗人VSIG1抗体，1∶200，R&D Systems)，在4 ℃的环境下孵育过夜，并在0.01 mol/L的PBS中漂洗3×5 min，低价生物素标记的二抗室温下孵育30 min，同时需要在0.01 mol/L的PBS中漂洗3×5 min，最后低价链霉素抗生物素-过氧化物酶复合物室温下孵育20 min，并在0.01 mol/L的PBS中漂洗3×5 min，滴入DAB显色液进行显色，使用自来水进行冲洗将反应终止，可以使用苏木素再次染色，并使用1%的盐酸酒精进行数秒钟的分色，流水进行冲洗，并用0.1%的氨水进行返蓝处理，最后使用镜检方法进行检测，并以阳性片作为阳性对照。共检测了50对癌组织及癌旁组织标本。

三、评判标准

每张切片随机选取5个不重叠并完整的高倍视野，测定视野下反映的阳性面积，所有标本VSIG1免疫染色的强度和范围经双盲测定，阳性染色比例评分为0(0%～9%)、1(10%～25%)、2(26%～50%)和3(51%～100%)；强度评分为0(无着色)、1(轻度着色)、2(适中着色)和3(深度着色)；总评分为强度和范围的综合(0～9)，VSIG1表达水平定义为0分阴性(-)、1～3分弱阳性(+)、4～6分阳性(++)、7～9分强阳性(+++)。

四、统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件进行分析，癌组织与癌旁组织间VSIG1蛋白表达水平的比较采用Student't检验，VSIG1表达与临床病理资料的相关性采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、膀胱癌组织中VSIG1蛋白的表达

Western blot检测发现，20对中有13例冷冻膀胱尿路上皮癌组织标本VSIG1的表达较其相对应的癌旁正常膀胱黏膜组织明显下降。其中3对的表达比较见图1。

图1 3对膀胱尿路上皮癌组织及癌旁正常黏膜组织VSIG1蛋白的表达(C：癌组织；N：癌旁组织)

二、石蜡包埋膀胱尿路上皮癌组织块中VSIG1基因的表达

免疫组织化学法分析结果显示，所有50例癌组织标本中，67% VSIG1表达阴性(-)，33% VSIG1弱阳性表达(+)；50例相对应的癌旁组织中能够见到较高密集分布的棕黄色颗粒，VSIG1呈高表达状态(++)。见图2。

三、不同病理分级和临床分期膀胱尿路上皮癌组织中VSIG1的表达

将免疫组织化学检测结果与患者的临床基本资料进行分析发现，VSIG1基因的表达和肿瘤的TNM分期存在相关性，不同T分期及N分期之间差异有统计学意义(P<0.05)，但不同年龄及性别的患者比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

A：癌旁组织，VSIG1表达(++)；B：低级别膀胱尿路上皮癌组织(T1N0M0)，VSIG1表达(+)；C：高级别膀胱尿路上皮癌组织(T3N1M0)，VSIG1表达(-)图2 石蜡包埋组织中VSIG1的免疫组织化学分析(×40)

一般资料例数VSIG1(+)VSIG1(-)χ2P值总数50(100.0)1337性别 男41(82.0)10310.3070.580 女9(18.0)36年龄(岁) ≥6036(72.0)9270.0670.796 <6014(28.0)410TNM分期 T分期 T118(36.0)999.1480.010 T225(50.0)421 T3～T47(14.0)07 N分期 N035(70.0)12234.1630.041 N1～N315(30.0)114

讨 论

膀胱尿路上皮癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，其最初临床表现多为间歇、无痛性全程肉眼血尿，也有部分患者为镜下血尿，随着病情的发展，可能出现尿频、尿急、尿痛，甚至排尿困难等不适症状。尽管多数为低级别尿路上皮癌，但术后极易复发，且部分膀胱癌患者在确诊时已经发生远处转移[4]，若不及时采取有效的治疗措施，会严重危害患者的身体健康，甚至威胁到患者的生命。膀胱癌的病因较为复杂，不仅有内在因素，同时也有外在的环境因素。而其发生、发展是一个多基因、多因素参与的复杂的病理生理过程[5]。明确与膀胱癌发生、发展相关的基因及其作用机制，筛选膀胱癌生物学标志物并进一步分析其对膀胱癌发生和进展的作用有着重要的临床价值。

VSIG1是免疫球蛋白超家族成员，更确切地说是紧密连接黏附分子家族成员。VSIG1基因位于染色体Xq22.1上，是一种单克隆基因，长度约34 kb，包含7个外显子，不同的外显子分别编码蛋白不同的区域。VSIG1蛋白包括含有233个氨基酸的细胞外区域，23个氨基酸的跨膜区域，以及131个氨基酸的细胞内区域。该蛋白分子量为45～70 kDa。VSIG1 mRNA的表达高度局限于正常组织，研究者通过免疫组织化学方法对31种不同正常组织的VSIG1表达进行了检测，发现只有正常胃黏膜及睾丸生殖细胞存在VSIG1高表达，而在胃癌、食管癌及卵巢癌等组织中其表达水平有不同程度的下降。Chen等[6]研究发现，VSIG1在胃癌组织中的表达较正常胃黏膜明显下降，且与肿瘤的恶性程度、侵袭转移相关，其可能的机制是，VSIG1参与了细胞间紧密连接功能，当表达下降时，紧密连接结构受到破坏，促进肿瘤细胞的侵袭转移。

本研究应用Western blot检测了20对膀胱尿路上皮癌及癌旁正常膀胱黏膜组织中VSIG1蛋白的表达，结果发现VSIG1蛋白在膀胱尿路上皮癌组织呈低表达，而在同一患者的癌旁正常组织中呈中高表达。这与VSIG1在其他部位肿瘤组织中的表达是相似的[3]。可以判定VSIG1作为紧密连接黏附分子同样参与了膀胱正常黏膜组织的结构和生理功能。

本研究通过免疫组织化学技术对膀胱尿路上皮癌组织中VSIG1蛋白的表达水平进行了检测，结果发现67%的膀胱尿路上皮癌未见明显VSIG1蛋白表达，33%表达弱阳性，相比之下，癌旁正常膀胱黏膜几乎都可见VSIG1蛋白阳性表达。通过分析我们发现，这67%VSIG1表达阴性的患者大多数是高级别尿路上皮癌患者。结合所检测的50例膀胱尿路上皮癌患者的临床病理资料，发现VSIG1表达强度与性别和年龄无明显相关，但与TNM分期显著相关，T、N分期级别越高，VSIG1表达强度越弱，肿瘤恶性程度与VSIG1的表达呈负相关。这提示VSIG1在膀胱癌的进展过程中发挥了重要的作用，可能是肿瘤细胞VSIG1表达下降，细胞间紧密连接结构受到破坏，使得癌细胞可以轻松地发生侵袭和转移，但具体的分子机制有待进一步研究。本研究未行M分期与VSIG1表达强度的相关性分析，原因是所有标本均来源于行膀胱全切术患者，而发生膀胱癌远处转移的患者一般不接受膀胱全切术。但在胃癌的研究中已证实VSIG1阴性表达与M分期显著相关[6]。

本研究显示，VSIG1有可能是一种抑癌基因，其在膀胱尿路上皮癌组织中的失表达极有可能会促进膀胱尿路上皮癌的发生和进展。在患者膀胱黏膜组织中高表达VSIG1基因，可能有助于抑制肿瘤的发生和发展，对患者的临床早期诊断以及治疗有一定的指导性作用。因此，我们将进一步探索VSIG1基因在膀胱尿路上皮癌组织中表达降低的相关机制，以期对膀胱癌患者的早期诊断和预后判断提供临床依据。