细胞凋亡和有效吞噬在动脉粥样硬化斑块中的作用

李金阳，姚剑挺，盛思琪，田 野，王丽娜

(哈尔滨医科大学 病理学与病理生理学教研室， 黑龙江 哈尔滨 150081)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种发生在大中动脉壁上的慢性炎性反应疾病[1],主要由脂质代谢失衡和炎性反应消退障碍引起。AS不稳定斑块破裂导致的急性心血管事件(脑卒中和心肌梗死)是人类致死致残的首要原因[2]。因此，深入研究和探讨不稳定斑块破裂的机制，对于及时发现和治疗不稳定斑块，减少不良心血管事件具有重要临床意义。

AS斑块中凋亡细胞堆积过多和吞噬细胞对凋亡细胞清除功能障碍是不稳定斑块进展和破裂的重要原因。然而，不稳定斑块中吞噬细胞对凋亡细胞发生清除障碍的机制仍然不是很清楚。因此，本文主要针对巨噬细胞对凋亡细胞识别、摄取和吞噬的分子机制，以及对斑块稳定性的影响做一综述。

1 细胞凋亡在动脉粥样硬化斑块中的作用

在AS斑块中，氧化应激、缺氧、干扰素及过多的胆固醇沉积等多种因素可诱导所有类型细胞(内

皮细胞、平滑肌细胞、T淋巴细胞以及巨噬细胞)发生凋亡[3]。斑块内细胞凋亡的后果取决于细胞类型，斑块阶段以及凋亡细胞部位。斑块内皮细胞发生凋亡，导致斑块侵蚀，暴露的内膜下胶原与血流接触导致在无斑块破裂的情况下发生血栓事件[4]。平滑肌细胞凋亡则可能破坏纤维帽，导致斑块破裂。AS斑块中发生细胞凋亡的大部分细胞(40%以上)是巨噬细胞。巨噬细胞凋亡在斑块的不同阶段作用存在不同。动物研究表明，巨噬细胞凋亡能抑制斑块进展。对LDL-/-小鼠移植 Bax-/-小鼠的骨髓后，小鼠血管斑块病变明显增加。G2a-/-apoE-/-小鼠巨噬细胞凋亡减少，在病灶区堆积的大量巨噬细胞增加动脉粥样硬化斑块的进展[5]。然而，另有研究表明，巨噬细胞的凋亡会促进坏死核心的形成和斑块的进展。在apoE-/-或者LDL-/-小鼠的背景上，同时敲除C/EBP蛋白，明显减少胆固醇诱导内质网应激引起的巨噬细胞凋亡，同时抑制坏死核心的形成和斑块的进展。巨噬细胞凋亡对斑块进展产生的相反作用可能主要取决于斑块的不同阶段。在apoE-/-小鼠喂养5周高脂饮食后，巨噬细胞凋亡增加会缩小斑块面积。而在喂养15周高脂饮食后，再增加巨噬细胞的凋亡反而加重斑块的发展。以上研究表明，在早期斑块中，巨噬细胞凋亡通过减轻炎性反应抑制斑块进展。而在进展期斑块中，有效吞噬功能障碍，凋亡的巨噬细胞无法及时有效的清除，进而发生继发性坏死，加重炎性反应和斑块进展。

另外，细胞凋亡在AS斑块的促凝活性中同样发挥了重要作用[6]。首先，斑块中的凋亡细胞是组织因子的重要来源，可以强烈激活凝血级联反应。此外，在凋亡过程中外翻的磷脂酰丝氨酸同样可以增加组织因子活性。在斑块中，细胞凋亡过程中脱落的凋亡小体也具有促凝活性，可以促进斑块局部或全身血栓形成。最后，不稳定斑块中的组织因子主要聚集在坏死核心周围的巨噬细胞中，加剧斑块血栓形成的风险[7]。综上所述，细胞凋亡在斑块进展、破裂和血栓形成过程中发挥了重要作用。

2 有效吞噬是斑块清除凋亡细胞的主要方式

有效吞噬(efferocytosis)主要是指吞噬细胞吞噬凋亡细胞的过程，包括趋化吞噬细胞，凋亡小体的识别、吞噬和吞噬后免疫反应[8]。正常情况下体内的凋亡细胞能够被巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞等专职和非专职吞噬细胞及时有效地吞噬清除，以防止细胞内自身抗原等内容物的释放和机体自身免疫应答的激活。快速有效的凋亡细胞清除能力导致在正常的组织切片中很难看到凋亡细胞的存在。

2.1 斑块中细胞凋亡释放“find me”信号趋化吞噬细胞

凋亡细胞能够释放“find me”信号分子以有效的募集吞噬细胞。当细胞发生caspase依赖的凋亡时，casepase 3激活磷脂酶A2裂解磷酯酰胆碱，形成具有趋化活性的溶血卵磷脂。此外，小分子物质ATP、UTP和S1P 分别作用于P2Y2嘌呤受体和CX3C受体，发挥趋化功能。在凋亡过程中产生的微泡和 miRNA也会行使“find me”信号功能趋化吞噬细胞并抑制斑块进展。另外，细胞坏死或凋亡晚期释放蛋白类物质来趋化吞噬细胞，进而改变免疫系统的功能，如HMGB1、热休克蛋白和尿酸等[9]。

2.2 斑块凋亡细胞表达“eat me”信号促进有效吞噬

斑块内凋亡细胞除释放“find me”信号募集吞噬细胞外，还在细胞膜表面表达“eat me”信号以促进吞噬。在斑块中，有效吞噬能否有效进行，取决于“eat me”信号和“don’t eat me”信号表达的程度。正常细胞表面表达CD31和CD47等“don’t eat me”信号，保护其不被吞噬细胞吞噬。同时，凋亡细胞的膜结构与正常细胞明显不同。细胞凋亡过程中外翻的磷酯酰丝氨酸(phosphatidyl serine, PS)是一种强“eat me”信号。多种吞噬受体，例如脑特异性血管新生抑制剂1和T细胞免疫球蛋白受体，可与之结合促进吞噬[10]。然而，最新研究表明，仅PS外翻不足以促进有效吞噬。一些桥梁分子可促进凋亡细胞表面PS与吞噬细胞表面受体结合，如血浆β2糖蛋白与吞噬细胞表面的β2糖蛋白受体结合，蛋白S在PS与吞噬细胞表面的MER受体连接中发挥桥梁分子的作用，以促进吞噬细胞吞噬清除凋亡细胞[11]。其他分子如补体因子C1q、iC3b、pentraxins、 thrombospondin- 1等都能够促进凋亡细胞与吞噬细胞表面模式识别受体结合[10]。

2.3 斑块中吞噬细胞表达有效吞噬受体促进有效吞噬

在进展期斑块中，尽管“find me”和“eat me”信号的大量存在，如果ox-LDL等物质阻断吞噬细胞表面的有效吞噬受体，有效吞噬过程仍然不能充分发挥作用。Mer酪氨酸激酶受体是吞噬细胞表面的重要有效吞噬受体。基因敲除Mer蛋白受体后导致斑块凋亡细胞堆积和坏死核心的扩大[12]。基质金属蛋白酶ADAM17可以切割吞噬细胞表面的Mer蛋白受体，使有效吞噬过程受阻。CD36不仅参与ox-LDL的吞噬，同时参与thrombospondin介导的有效吞噬。当ADAM17降解CD36后，有效吞噬过程受阻，凋亡细胞清除能力下降[13]。在ADAM17敲除的小鼠中，有效吞噬增强，斑块炎性明显消退[14]。以上研究表明，有效吞噬受体对于斑块有效吞噬的过程同样重要。

3 有效吞噬功能障碍加剧动脉粥样硬化斑块进展

AS进展期斑块中存在胞外凋亡碎片、游离凋亡小体和大量吞噬细胞，这些现象提示有效吞噬功能障碍可能是造成斑块凋亡小体堆积的最主要原因。值得注意的是，有效吞噬的相关研究大多利用组织切片进行显微镜观察，从而寻找凋亡细胞和吞噬细胞的共定位关系。如果凋亡细胞与吞噬细胞上下重叠，区分凋亡细胞是与吞噬细胞相黏附还是被吞噬十分困难。更为重要的是，对凋亡细胞的有效吞噬过程进行实时观察很难在体内水平实现。这也是未来研究斑块有效吞噬过程的一个重要发展方向。

在斑块进展过程中，巨噬细胞功能变化和泡沫细胞形成亦为有效吞噬障碍的重要原因。ox-LDL在斑块聚集加重斑块的氧化应激反应，促使泡沫细胞形成，损伤巨噬细胞的吞噬功能[15]。改善巨噬细胞胆固醇代谢可使有效吞噬过程中的桥梁分子MFGE8表达上调，而斑块坏死区的巨噬细胞MFGE8表达量明显下降[16]。另外，巨噬细胞膜表面脂肪酸含量增高会削弱细胞的吞噬能力。在ob/ob LDL-/-小鼠中，富含鱼油的饮食可以明显增强巨噬细胞吞噬能力[17]。最后，斑块的炎性反应也会抑制有效吞噬的过程。炎性环境下，有效吞噬受体MERTK被切割，形成溶解性的MERTK受体，使吞噬细胞有效吞噬能力明显减弱。

除巨噬细胞外，未成熟的树突状细胞(dentritic cells, DCs)也存在于AS斑块中，并在有效吞噬过程中发挥重要作用[18]。DCs吞噬功能不及巨噬细胞，但在斑块整体的免疫信号传导中，发挥更为重要的作用。未成熟的DCs主要执行吞噬功能，成熟之后主要执行抗原呈递功能。斑块巨噬细胞可以转变为DCs，在吞噬凋亡小体后迁移至淋巴器官。目前为止，关于斑块中不同种类的吞噬细胞执行有效吞噬后产生的不同免疫反应尚缺乏系统研究。

研究表明，斑块凋亡细胞清除障碍会导致继发性坏死，引起细胞炎症内容物释放，加重斑块炎性环境[19]。在小鼠模型上分别敲除MER受体，桥梁分子MFGE8或C1q，不仅病变部位未被吞噬的凋亡细胞增多，还会引发自身免疫性病理改变。由此可知，MER受体或MFGE8介导的信号通路不仅参与了有效吞噬过程，同时具有免疫抑制效果。另有证据表明巨噬细胞在吞噬凋亡小体的过程中，激活PPAR-δ以维持免疫耐受。在小鼠中敲除PPAR-δ后，引起调理素(C1q, MFGE8和MERTK)表达水平明显下降，有效吞噬受阻和自身免疫性反应，加重斑块的进展。此外，MFGE8的缺失使斑块中促炎型TH1细胞增多，斑块炎性反应进一步加重。同时，体内和体外研究表明，apoE基因不仅可以调控脂质代谢，还能促进凋亡细胞的清除[20]，这也可以从另一个侧面解释apoE-/-小鼠易于形成斑块的原因。

值得注意的是，凋亡细胞增多和有效吞噬障碍不仅存在于AS中，还存在于其他自身免疫病中，如系统性红斑狼疮。在斑块中，凋亡细胞清除障碍会引起继发性坏死，抗原提呈异常和免疫系统的慢性激活。因此，患有系统性红斑狼疮的患者，心血管事件的发生率也明显增加。

4 凋亡细胞清除障碍是治疗动脉粥样硬化斑块的新靶点

细胞凋亡和凋亡细胞清除障碍是造成斑块进展和不稳定的重要原因，因此，许多针对细胞凋亡过程和吞噬清除以稳定斑块的新疗法应运而生。在进展期斑块中通过抑制内质网应激可以明显减少巨噬细胞凋亡，增加斑块稳定性[21]。给予化学伴侣分子治疗apoE-/-小鼠，斑块内质网应激减轻，巨噬细胞凋亡明显减少，斑块稳定性增加[22]。低强度的内质网应激能通过促进自噬清除巨噬细胞，而在进展期斑块中，高强度的内质网应激抑制自噬，促进巨噬细胞凋亡和斑块坏死核心形成。采用依维莫司(雷帕霉素抑制剂)促进巨噬细胞自噬不仅显著抑制小鼠斑块的进展，还增加了斑块的稳定性。在高脂喂养的兔动脉粥样硬化模型中，依维莫司洗脱支架通过诱导自噬减少斑块中巨噬细胞含量。

促进有效吞噬功能恢复同样是药物研发的重点。过氧化物增殖激活受体和肝X受体的特异性激动剂，能促使巨噬细胞向M2型分化并增加斑块有效吞噬能力，然而，严重的不良反应却限制其使用。最近一项研究表明，新型肝X受体激活剂R211945，能使兔斑块消退而不产生明显不良反应[23]。S1P的化学合成模拟剂FTY720具有抗感染和促进有效吞噬功能[24]，减少坏死核心和斑块面积已经在临床用于治疗多发性硬化，在ACS患者的使用却尚未见报道。另外，增加凋亡细胞表面的PS与吞噬细胞表面受体结合，以达到增强有效吞噬的目的。研究表明，含有Annexin V(结合PS)和Arg-Gly-Asp序列(结合吞噬细胞的vitronectin受体)的融合蛋白增加了有效吞噬的能力，但其临床使用仍需进一步研究。

5 问题与展望

细胞增殖、凋亡和死亡细胞的清除在机体器官发育和维持内环境稳态的过程中发挥了重要的作用[25]。在进展期斑块中，细胞凋亡增加，有效吞噬功能受损导致凋亡细胞不能及时有效清除，斑块炎性反应加重，甚至造成斑块破裂、血栓形成。细胞凋亡和有效吞噬的机制研究以及如何向临床转化，对于防治斑块破裂导致的急性心血管事件具有重要意义。

目前尚存在以下几个主要问题急需解决：1)基于有效吞噬的治疗存在某些不良反应，如CD47单克隆抗体虽能促进有效吞噬增加，但也可能导致贫血。因此如何克服这些不良反应是其向临床转化的关键；2)有效吞噬的研究主要靶标是巨噬细胞和树突状细胞，对于平滑肌细胞在有效吞噬中的作用还不清楚；3)在其他心血管疾病中是否存在相同的有效吞噬机制，能否将AS斑块中有效吞噬机制移植到其他相似心血管疾病中，需进一步研究。

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肥胖儿童的肠道细菌有所不同

据美国WebMD医学新闻网(2016- 09- 21)报道，一篇新研究报告指出，肥胖儿童与青少年消化道内的菌群有别于正常体质量的同龄者。

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这项研究发表于2016- 09- 20《临床内分泌与代谢》。