microRNAs与肿瘤及肿瘤干细胞的研究进展

徐小涛，吉婷婷

(1.江苏联合职业技术学院南京卫生分院，江苏 南京 210038；2.南京市第一医院 肿瘤内科，江苏 南京 210029)

microRNAs是在真核生物中发现的一类21～25 nt长的非蛋白编码小分子RNA。microRNAs主要通过与靶标基因3′UTR的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译，从而对生物体的发育、分化、增殖、凋亡和免疫调控等活动进行精确调节[1]。近来，在多种肿瘤中发现了microRNAs的异常表达，并且与肿瘤进展、临床治疗和预后密切相关。microRNAs正逐渐成为肿瘤诊断和治疗的新兴靶点。本文就此方面的最新进展进行概述。

1 microRNAs与肿瘤发生、转移的关系

目前肿瘤的发生被广泛认为是由于一系列癌基因和抑癌基因的突变积累造成的。而microRNAs已被证实扮演抑癌基因和致癌基因的角色。

microRNAs参与肿瘤发生、发展的机制非常复杂。如发挥抑癌作用的let- 7与转录因子Lin- 28、原癌基因C-myc构成的多重负反馈回路在肿瘤发生过程中起到推动作用。一方面let- 7家族负向调控C-myc的表达；另一方面C-myc激活Lin- 28的转录，而Lin- 28又反过来抑制let- 7的合成[2]。此外，let- 7的靶基因还包括Ras基因、核转录因子E2F2和细胞周期蛋白D2(cyclinD1，CCND2)等，综合参与肿瘤的发生、发展与转移[3]。再如miR-29可通过诱导细胞周期阻滞和促进凋亡等途径抑制肿瘤的发生[4]。但另一方面，miR-29可通过上调多基因编码细胞外基质蛋白(extracellular matrixc，ECM)促进上皮细胞间质转换(epithelial-mesenehymal transition，EMT)的发生，从而增加乳腺癌的侵袭性[5]。

而致癌性的miR- 155通过下调其靶基因肿瘤P53蛋白诱导的核蛋白1(tumor protein 53 induced nuclear protein 1，TP53INP1)、DMTF1和转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的表达来促进多种细胞恶性转化和肿瘤细胞增殖[6]。miR- 17- 5p则通过负调控靶基因核转录因子E2F1、抑癌基因PTEN(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)、C-myc和组织金属蛋白酶抑制因子2(tissue inhibitor of metalloprotein-ase，TIMP- 2)等促进肿瘤的增殖、侵袭和转移[7]。 miR- 92a抑制抑癌基因p21的表达。在肝癌组织中miR- 92a表达显著升高，并且与肝癌患者预后不良显著相关[8]。

由此可见，无论是抑癌性microRNAs还是致癌性microRNAs，都是通过调控其下游肿瘤相关性靶基因的表达来影响肿瘤的发生和发展的。但是也有一些microRNAs例如miR- 29家族同时具有抑制肿瘤与促进肿瘤侵袭、转移的双重效应，因此需要不断寻找和确定更多的与肿瘤相关的microRNAs靶基因，并弄清靶基因之间错综复杂的关系网络，才能全面认识microRNAs在肿瘤发生、发展中的机制。

2 microRNAs与肿瘤干细胞

近年来大量研究显示，肿瘤可看作是干细胞增殖调控机制失调引起的异常组织器官，肿瘤干细胞在肿瘤发生和发展过程中起着关键性作用。而microRNAs对维持肿瘤干细胞特性起到基础性调控作用。

目前已经在多种肿瘤中发现了肿瘤干细胞的存在。侧群细胞(side population cell，SP细胞)是一群能够特异排出Hoechst 33342染料的具有干细胞特性的肿瘤细胞。通过对肺癌A549细胞株进行基因芯片分析发现，与肺癌非侧群细胞(non-side population cell，non-SP细胞)相比，肺癌侧群细胞(SP细胞)中miR- 31、let- 7和miR- 29显著低表达[9]。而且低表达的miR- 31和let- 7相互平衡调控着SP细胞自我更新和多向分化功能。miR- 31在SP中低表达能够维持肺癌SP细胞处于静止期，抑制SP细胞分化；而let- 7低表达能够加速G1-S期转换，促进SP细胞增殖与分化。低表达的miR- 29同样加速G1-S期转换，维持肺癌细胞高增殖能力[10]。

在乳腺癌，let- 7能够通过其下游靶基因H-RAS和高迁移率族蛋白A2(high mobility group A2,HMGA2)来调控肿瘤干细胞的自我更新和多向分化功能[11]。乳腺癌干细胞高表达长链非编码RNA(LncRNA) H19，通过海绵效应抑制let- 7成熟，继而导致Lin- 28表达增加，而Lin- 28又可以抑制因H19缺失导致乳腺癌干细胞特性的丢失[12- 13]。因此通过干预H19/let- 7/Lin- 28形成的双向负反馈回路有可能为肿瘤治疗带来新的思路。

由此可见，正是如let- 7这样的miRNA的功能异常使部分肿瘤细胞具备了干细胞特性，使之对放化疗更加耐受，同时侵袭性和转移性更加显著。因此借助miRNA干预肿瘤干细胞信号通路以彻底消灭肿瘤为肿瘤根治提供了广阔前景。

3 microRNAs的肿瘤诊断价值

随着分子生物学和血液检测技术的不断发展，microRNAs在肿瘤诊断中的应用价值不断被发掘。microRNAs能够抵抗血液中RNA酶的降解，在血清或血浆中可以被稳定检测，并且在多种肿瘤中可以作为新型的肿瘤诊断指标[14- 15]。

例如血清miR- 21的表达水平随直肠癌临床分期呈阶梯状升高。而且在腺瘤性息肉组织尚未构建完整血供时，血清miR- 21表达水平便开始增高。该指标的灵敏度和特异度都达到80%以上。此外，miR- 21高表达水平与结肠直肠癌(colorectal cancer，CRC)患者预后较差相关，其可作为影响CRC患者生存的独立预后因素[16]。同样利用miR- 21，合并miR- 155 和miR- 365的组合筛查能够使乳腺癌筛查得到更高的敏感性和特异性[17]。在乳腺癌患者血清中miR- 21和miR- 155水平显著增高，而miR- 365水平显著下调。而与Ⅰ期和Ⅱ期患者相比，血清miR- 155水平在Ⅲ期患者中明显升高。因此进一步探索microRNAs在乳腺癌筛查中的应用可以取得高于传统指标，例如CA- 153和CEA的检出率。

在肝癌中，血清miR- 29a、miR- 29c、miR- 133a、miR- 143、miR- 145、miR- 192和miR- 505均明显升高。利用这7个microRNAs建立分类器来检测肝癌的准确性和敏感性远高于血清AFP和B超，尤其是检测小肝癌(肿瘤大小≤3 cm)和早期肝癌的优势更加明显[18]。

由此可见，microRNAs在肿瘤诊断尤其是早期诊断中具有重要价值。如果继续扩大对血清microRNAs的筛查范围，并且对肿瘤不同阶段外周血microRNAs表达谱进行研究，继而为每一种肿瘤建立起完善准确的肿瘤microRNAs表达谱，这样必将能够大大促进肿瘤的早期发现和早期治疗。

4 microRNAs的肿瘤治疗价值

基于对microRNAs与肿瘤发生和发展关系的不断深入了解，microRNAs逐渐成为肿瘤治疗领域另一个新兴靶点。目前microRNAs肿瘤治疗研究主要包括两个方面，一是通过microRNAs类似物恢复抑癌microRNAs的表达，即使microRNAs表达上调；二是通过microRNAs拮抗剂抑制致癌microRNAs的表达，即microRNAs沉默。

目前作为重要抗癌靶点研究的microRNAs有miR- 34、let- 7、miR- 21和miR- 221等。miR- 34能抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(cyclin-dependent protein kinases 4/6，CDK4/6)、癌基因Myc、组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase1,HDAC1)、B淋巴细胞瘤- 2基因(B-cell lymphoma- 2，Bcl- 2)、Wnt和转移相关基因2(metastasis-associated gene 2，MTA2)等一系列靶基因[19]。由于在多种肿瘤中miR- 34表达下调，因此通过微纳米和脂质体等技术导入外源性miR- 34可以上调其表达，从而起到抑制肿瘤效应。例如MRX34是一种miR- 34的脂质体模拟物，从肝癌小鼠静脉注射MRX34能显著延长生存时间。目前MRX34已经在多种晚期实体肿瘤上进行了I期临床试验[20]。另一种具有癌基因作用的miR- 21在多种肿瘤中表达过量，能够抑制多种抑癌基因如PTEN、 原肌球蛋白1 (tropomysin 1，TPM1)和程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4,Pdcd4)的表达[21]。在肝癌细胞株HepG2中利用超声微泡转染miR- 21/221抑制剂表达质粒能够显著抑制癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡[22]。

miR- 96通过靶向转录调节因子FOXO1和FOXO3a阻止细胞程序化死亡，促进多种癌细胞生长[23]。针对miR- 96设计的药物Targaprimir- 96能显著抑制miR- 96的表达，诱导细胞程序化死亡，显著抑制肿瘤生长。并且Targaprimir- 96具有很高的特异性，仅作用于miR- 96高表达的肿瘤细胞，对正常细胞没有影响[24]。这对于精准杀伤肿瘤细胞、降低药物不良反应具有重要意义。

miR- 195、miR- 193a和 miR- 214能靶向几乎所有细胞周期蛋白(cyclin)和细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent protein kinases，CDK)，有效抑制癌细胞增殖。尤其是miR- 193a对3阴乳腺癌(雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体2表达为阴性)细胞抑制作用最明显。利用纳米颗粒递送miR- 193a- 3p能够抑制7种小鼠异种移植乳腺癌模型中的肿瘤生长，包括3种复发患者来源的肿瘤[25]。

以上结果表明，正因为microRNAs在多种肿瘤临床前治疗研究中显示出优于常规肿瘤治疗效果的优势，所以越来越多的新型microRNAs药物逐渐进入各级临床试验研究。无论是具有高度特异性的Targaprimir- 96，还是能靶向几乎所有细胞周期蛋白和CDK的miR- 193a，都提示未来microRNAs药物具备成为拥有特异性、广谱性和高效性抗肿瘤药物的潜力。

5 存在的挑战与展望

随着对microRNAs在多种肿瘤中参与机制的不断深入研究，microRNAs在肿瘤发生和转移以及利用microRNAs对肿瘤进行诊断和治疗等方面都有了多方面和深层次的积累。microRNAs作为一个有前途的肿瘤诊治靶标逐渐进入了人类攻克肿瘤的进程。随着microRNAs在参与肿瘤发生和转移中机制的进一步阐明，microRNAs必将成为肿瘤治疗的重要靶点。而利用基因手段增强或“沉默”特定microRNAs在肿瘤组织中的表达来治疗肿瘤，阻止肿瘤的进展和转移，为肿瘤防治带来了新的思路。但是microRNAs与肿瘤的研究目前主要还处在基础研究阶段，而且大部分功能性研究都是在体外或者动物模型上进行，离应用于临床还有很长一段距离。由于microRNAs作用于转录后水平调控，而且其目标靶基因数目众多，如何设计出能够锁定肿瘤特异靶基因的microRNAs药物也是亟待解决的问题。另外microRNAs靶标的设定和检测标准以及衍生microRNAs作为药物的给药标准尚未建立，这对评估治疗的有效性和安全性都提出了巨大的挑战。不过相信随着microRNAs在肿瘤相关研究中的进一步深入，随着生物信息学、生物芯片技术和real-time PCR 等现代生物学技术应用于microRNAs的研究，特别是针对肿瘤干细胞群体的研究，定能解开其复杂的生物学功能，使microRNAs相关研究成果真正应用于临床，发挥其独到的肿瘤防治作用。