辽宁沈阳甜椒曲叶病的病原鉴定

杨彩霞, 付晶晶, 韩 彤, 廖一鸣, 李 莉, 于美春

(沈阳大学生命科学与工程学院/辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室，辽宁 沈阳 110044)

植物杆状病毒科(Virgaviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)病毒是一类无包膜的大小为(300～310) nm×18 nm的杆状病毒.基因组为一条长6.3～6.6 kb的正单链RNA，至少编码4个蛋白，参与病毒的包装、移动和复制，分别为衣壳蛋白(coat protein,CP)、 移动蛋白(movement protein,MP)和2个复制蛋白(replicase,Rep).自然条件下该属病毒可通过汁液摩擦和种子传染[1].目前，该属病毒有25个确定种.其中，辣椒轻斑驳病毒(Peppermildmottlevirus，PMMoV)发生范围最广，在全球辣椒种植区均能发生和为害[2-8]；PMMoV还在土壤、加工食品、饮用水、污水和劳动工具上被检测到，并且具有侵染活性[9-13].PMMoV的高致病性和强抗逆性是其在世界范围内广泛分布的重要原因.依据PMMoV克服寄主L系列等位基因L1、L1a、L2、L3和L4介导的抗性能力，将其分为P0、P1、P1,2、P1,2,3和P1,2,3,45种致病型[14-15].目前，中国报道的PMMoV均属于P1,2型，在北京、河北、宁夏、新疆、江西、贵州、湖南、福建、云南、湖北、四川、江苏、广西、山东和辽宁等地[16-23]被发现，给我国辣椒产业造成重大损失.本研究从辽宁省沈阳市表现严重曲叶症状的甜椒上分离到病菌，对其进行电镜观察和RT-PCR检测，并对其致病性进行测定，以明确该病害的致病菌，为其防治提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

图1 甜椒感染PMMoV的症状(A)和病毒粒子形态(B)Fig.1 Symptoms of the infected sweet pepper plants (A) and morphology of viral particle (B)

2015 年7月于辽宁省沈阳市大东区采集具有严重曲叶症状的甜椒叶片(图1A)，置于-80 ℃超低温冰箱内保存.摩擦接种用的辣椒(Capsicumannuum)和心叶烟(Nicotianaglutinosa)种子由福建农林大学植物病毒研究所吴祖建研究员惠赠.

1.2 方法

1.2.1 透射电镜观察 取具有典型曲叶症状的甜椒叶片置于研钵中，加少量磷酸盐缓冲液(phosphate buffer,PB)，研磨至匀浆状，6 000 r·min-1离心3 min.取上清，铜网置其中吸附1 min后，于2%磷钨酸中染色10 s，置于透射电镜(Hitachi TEM system)下观察.

1.2.2 植物总RNA的提取及病毒的RT-PCR检测 采用RNA Simple Total RNA Kit[天根生化科技(北京)有限公司]提取甜椒病叶总RNA，再利用TIANScript RT Kit[天根生化科技(北京)有限公司]反转录合成第一链cDNA.具体操作：总RNA 3.0 μL, Oligo(dT)15(10 μmol·L-1) 2.0 μL，Super Pure dNTPs (2.5 mmol each) 2.0 μL，补RNase-Free ddH2O至14.5 μL后混匀，置70 ℃金属浴加热5 min，迅速在冰上冷却2 min，短暂离心后加入TIANScript M-MLV反转录酶(200 U·L-1) 1.0 μL、RNase抑制剂(20 U·μL-1) 0.5 μL、5×First-Strand Buffer 4.0 μL，混匀后置于42 ℃下50 min，90 ℃ 5 min终止反应，置冰上冷却后加入RNase-Free ddH2O至50.0 μL备用.

以上述cDNA作为模板，用Tobamovirus检测通用引物TMV-mpf(AGTTGTTGATGAGTTCATGGA)/TMV-3nr(CAACCCTTCGATTTAAGTGGA)[24]进行PCR扩增(引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成).PCR反应体系为25 μL，循环参数：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min.用1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，目的片段经TIANgel Midi Purification Kit[天根生化科技(北京)有限公司]回收和纯化.将纯化产物与克隆载体pMD18-T[宝生物工程(大连)有限公司]于16 ℃金属浴中连接1 h，连接产物转入感受态细胞DH5α菌株中，于37 ℃倒置培养过夜.挑取单菌落，于37 ℃、280 r·min-1摇床培养7 h，取2 μL菌液进行PCR鉴定.测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成.

1.2.3 序列分析 序列同源搜索利用NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库的BLAST程序(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)完成.同源性分析利用DNAStar的Clustal V程序完成.对于进化树构建，先利用Clustal_X version 1.83[25]进行完全联配，再用软件MEGA version 5.0[26]的最大似然法绘制，置信度设置为1 000，分支节点上的数值为后验概率(>50%).用于序列同源性比较和系统进化树构建的病毒序列信息见表1.

1.2.4 摩擦接种试验 将RT-PCR检测呈PMMoV阳性的辣椒植物作为毒源，采集1.0 g新鲜病叶，置于研钵中，经0.1 mol·L-1PB研磨成匀浆状后用纱布过滤得到初提病汁液.在辣椒和心叶烟健康植物叶片上撒少许金刚砂，蘸取病汁液单向摩擦叶片3次，接种植物放置0.5 h，用蒸馏水洗去叶片残留物，置温室中观察叶片变化.试验设3个重复，同时设阴性对照(健康植物只接种PB溶液，不接种病毒).所有植物置于26 ℃温室中，每3 d观察一次症状并记录.

2 结果与分析

2.1 辣椒病叶的电镜观察结果

将新鲜辣椒病叶于透射电镜下进行病毒粒子的负染色观察，可见300 nm×18 nm的线性粒子，病毒粒子外表面无包膜(图1B).病毒粒子形态特征显示，该病毒应为Tobamovirus成员，而健康植物叶片中没有这种病毒粒子.

表1 PMMoV沈阳Pepsy分离物与其他报道的PMMoV分离物cp基因的核苷酸和氨基酸序列同源性1)Table 1 Percentage of nucleotide sequence identity and amino acid identity between cp gene of PMMoV isolate Pepsy of Liaoning and other published PMMoV

1)nt:核苷酸;aa:氨基酸.

2.2 RT-PCR检测结果

M:DL2 000 DNA marker;1-9:辣椒病样;10:健康辣椒;CK:水.图2 PMMoV的RT-PCR检测结果Fig.2 RT-PCR detection of PMMoV

以甜椒病叶cDNA为模板，利用引物TMV-mpf/TMV-3nr进行PCR扩增，得到1条约770 bp的特异性片段，而健康辣椒中未检测到该片段(图2).测序结果显示，该片段长度为769或771 nts(KX524520-KX5245202, KY234288-KY234293).Blast比对显示该片段序列与PMMoV高度同源，同源性为94%～99%，包含474 nts的完整cp基因.

2.3 序列分析

PMMoV 9个沈阳分离物cp基因的核苷酸序列同源性和CP蛋白的氨基酸序列同源性均为98.3%～100.0%(表2)，可见它们属同一个分离物，后续选取分离物Pepsy进行同源性分析.基于cp基因将PMMoV Pepsy分离物与GenBank中已报道的PMMoV各个分离物进行比对，核苷酸同源性为93.7%～99.8%，氨基酸同源性为96.8%～100.0%，其中与PMMoV北京分离物(PMMoV-[CN:BJ], AY859497)的同源性最高，均达100%(表1).系统进化树表明，沈阳PMMoV 9个分离物与P1,2型 PMMoV聚在一个大分支上，而P1,2,3型和P1,2,3,4型聚在另一个分支上，TMV-[CN:FJ](AF395127)作为外群单独聚在一个分支上(图3).

表2 PMMoV沈阳9个分离物之间的CP同源性1)Table 2 Sequence identities based on the cp of 9 Shenyang isolates

1)nt:核苷酸;aa:氨基酸.

图3 基于报道的PMMoV和PMMoV沈阳分离物cp基因构建的系统进化树Fig.3 Phylogenetic trees based on cp sequences of Shenyang isolates and other previously reported PMMoV

2.4 摩擦接种

接种6 d后，心叶烟的接种叶片出现了明显的浅褐色局部坏死斑(图4B)，但系统叶片上始终无症状出现(图4C).辣椒的接种叶片在接种9 d后出现局部坏死斑(图4I)，系统叶片在接种30 d后出现中度曲叶症状(图4J).利用引物TMV-mpf/TMV-3nr检测接种植物，发现心叶烟接种叶片中PMMoV呈阳性，系统叶片中PMMoV呈阴性(图4G)；而在辣椒的接种叶片和系统叶片中PMMoV均呈阳性(图4N).2组阴性对照始终未表现症状(图4D-F，K-M)，且PMMoV检测呈阴性(图4G，N).上述结果表明，PMMoV仅可局部侵染心叶烟，根据斑点类型判断其为P1,2致病型；但是可突破辣椒的防御系统实现系统侵染.

IL.接种叶片；SL.系统叶片.A-F.心叶烟接种PMMoV后的症状表现；H-M.辣椒接种PMMoV后的症状表现.G和N分别为心叶烟和辣椒摩擦接种30 d后PMMoV的PCR检测结果[M:DL2 000 DNA marker；1-6:健康植株接种PMMoV;7-8:健康植株接种PB缓冲液.其中，1、3、5和7为接种叶片；2、4、6和8为系统叶片.CK+:PMMoV侵染样品；CK-:健康植株].图4 PMMoV在心叶烟和辣椒上的致病性检测Fig.4 Pathogenicity determination of PMMoV on N.glutinosa and C.annuum plants

3 讨论

李晓冬等[23]发现辽宁省葫芦岛地区温室大棚辣椒上暴发的病毒病与PMMoV有关.2015年起，在沈阳大东区田间有20%甜椒表现严重的曲叶症状.经电镜观察和分子检测确定该病害的相关病毒为PMMoV；进化树分析发现，PMMoV中国分离物均与P1,2型聚类，这与张强等[20]的分析结果一致.摩擦接种试验显示，PMMoV可传播到健康的辣椒上，可系统侵染辣椒并诱导中度曲叶症状的发生，证明PMMoV与甜椒重型曲叶病相关.但接种辣椒未见重型曲叶症状，可能有2种原因：(1)接种辣椒品种与自然发病的辣椒品种不同，接种症状受到辣椒基因型、接种时间以及接种温度等因素的影响；(2)尽管电镜观察和RT-PCR检测均未发现其他病毒的存在，但是不能完全排除这个可能性.例如，PMMoV在自然条件下可分别与属内的烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)和马铃薯Y病毒属的辣椒斑驳病毒(Peppermottlevirus,PepMoV)复合侵染辣椒[21,27].本研究虽然未能完全验证柯赫氏法则，但证明了PMMoV与重型甜椒曲叶病害相关.由于PMMoV的致病性和存活能力较强，极易扩散蔓延，为避免其给农业生产带来威胁，有必要对这类病害进行防控.

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