RP-HPLC法同时检测新麦纤散中5种有效成分含量

浙江中医药大学基础医学院 杭州 310053

麦纤散是浙江中医药大学郑红斌教授研究的一种治疗溃疡性结肠炎的经验方[1]，新麦纤散复方制剂是在麦纤散（麦芽纤维、山药、茯苓）的基础上又配伍三七、白及所组成，主要针对溃疡性结肠炎的瘀毒病机，进一步改善患者腹痛、泻下粘液脓血的症状，缓解肠道炎症并缩短溃疡愈合时间。其中的麦芽、山药、茯苓是具有药食两用特性的天然药物，治疗脾胃病历史悠久[2-4]。方中将麦芽列为君药，山药、茯苓为臣药，以治本病脾虚之本；而又佐使以三七、白及解决其瘀毒之标，全方共奏健脾固肠、止血愈疡、消肿止痛、收敛生肌之效。

既往已有研究采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定三七中的三七皂苷R1和人参皂苷Rb1[5]、白及中的Coelonin[6]、山药中的薯蓣皂苷[7]和茯苓中茯苓酸的含量[8]，但同时测定以上5种成分含量的方法尚未见于文献报道。为了完善新麦纤散的质量控制，有必要建立一种对多个中药中多种成分的含量进行同步分析的测定方法。本研究采用反相高效液相色谱技术（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）建立同时测定以上5种有效成分含量的方法，为完善新麦纤散的质量控制提供实验依据。

1 仪器与试剂

1.1 主要仪器 Agilent1200高效液相色谱仪、G1329A型自动进样器、二极管列阵检测器（diode array detector，DAD）、G1311A 型四元泵、Agilent 1200色谱工作站均为美国 Agilent公司产品；AG135电子分析天平购于瑞士Mettler Toledo公司；KQ-500DE型数控超声波清洗仪购于昆山市超声仪器有限公司；粉碎机购自广州德章机械设备有限公司，Milli-Q超纯水机为美国Millipore公司产品。

1.2 试剂及药品 甲醇（色谱纯，购于德国MERCK公司，批号：20151016），乙腈（色谱纯，购于德国MERCK公司，批号：20150921），甲醇（分析纯，购于江苏永华化学科技有限公司，批号：20120409），磷酸（分析纯，购于江苏永华化学科技有限公司，批号：20141102）。发酵的麦芽粗纤维购于萧山啤酒厂，采用过滤槽法将麦汁（溶于水的浸出物）和麦糟（残留的皮壳、高分子蛋白质、纤维素、脂肪等）分离；然后采用间接式加热干燥法烘干后压扁破碎，筛去皮壳，留取其中细粉部分，消毒干燥成型即得麦芽纤维，麦芽纤维纯度测定参考相关文献[9]。山药、茯苓、三七、白及4味中药的4个批次药物分别购于浙江中医药大学中医门诊部、浙江中医药大学名中医馆、浙江中医药大学附属第三医院名中医馆和胡庆余堂。标准对照品三七皂苷R1（批号：110703-201631）、人参皂苷Rb1（批号：110704-201625）、薯蓣皂苷（批号：111707-201402）、茯苓酸（批号：1110705201603）均购于中国药品生物制品检定所，Coelonin购于美国Sigma公司（批号：SMB00095）。

2 方法

2.1 色谱条件和色谱柱 采用phenomenex-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相采用乙腈和 0.1%磷酸水梯度洗脱；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长为203nm，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Scratch elution program

2.2 溶液制备

2.2.1 标准对照品溶液的制备 精密称取标准对照品三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Coelonin、薯蓣皂苷、茯苓酸各1.00mg，分别置于5mL容量瓶中，加一定量甲醇，摇匀，超声使其完全溶解，放至室温后加甲醇定容，得到三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Coelonin、薯蓣皂苷、茯苓酸标准对照品单体溶液，浓度均为0.20mg·mL-1。再精密称取标准对照品三七皂苷R1 3.25mg、人参皂苷 Rb1 2.10mg、Coelonin 0.40mg、薯蓣皂苷1.85mg、茯苓酸0.80mg，置于同一个5mL容量瓶，尽量使5种成分的比例与样品中保持一致，然后加入一定量甲醇（分析纯），摇匀，超声使其完全溶解，放至室温后加甲醇定容，得到三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Coelonin、薯蓣皂苷、茯苓酸标准对照品混合溶液，其中三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Coelonin、薯蓣皂苷、茯苓酸浓度分别为 0.65mg·mL-1、0.42mg·mL-1、0.08mg·mL-1、0.37mg·mL-1、0.16mg·mL-1。将上述两种溶液用 0.45μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液备用。

2.2.2 样品溶液的制备 麦芽纤维、山药、茯苓、三七、白及粉末按 3：2：2：1：1 比例混合后，用超微粉碎机粉碎并混合均匀，得到新麦纤散粉剂。精密称取新麦纤散粉末3.00g，置于100mL锥形瓶中，加入甲醇60mL，超声1h后室温放置15min，取上清液，滤渣加30mL甲醇，超声30minF口取上清液，合并两次上清液，经旋转蒸发回收，最终定容为5mL，用0.45μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液备用。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 新麦纤散中薯蓣皂苷、茯苓酸、三七皂苷R1与人参皂苷Rb1、Coelonin分别来自中药山药、茯苓、三七、白及，根据新麦纤散处方组成比例，按照2.2.2样品溶液的制备方法，分别配置缺山药、缺茯苓、缺三七和缺白及的阴性样品溶液，备用。

2.3 专属性实验 分别取标准对照品混合溶液、样品溶液及各阴性样品溶液，按2.1项色谱条件分别进行进样分析，进样量为10μL，记录色谱图。

2.4 标准曲线及线性关系考察 取标准对照品混合溶液适量，甲醇稀释定容，得到一系列质量浓度的标准对照品混合溶液，按2.1项色谱条件进样，进样量为10μL，记录色谱图。

2.5 精密度实验 分别取同一标准对照品混合溶液，按2.1项色谱条件连续自动进样8次，进样量为10μL，记录色谱峰面积。

2.6 重复性实验 分别精确称取新麦纤散8份，每份3.00g，按2.2.2项制备方法平行制备样品溶液8份，按2.1项色谱条件分别进样，进样量为10μL，记录色谱峰面积，计算各成分含量。

2.7 稳定性实验 取制备好的同一样品溶液，室温放置，按2.1项色谱条件每2h进样一次，进样量为10μL，记录三七皂苷 R1、人参皂苷 Rb1、Coelonin、薯蓣皂苷和茯苓酸的色谱峰面积。

2.8 加样回收率实验 精密称取已知含量的新麦纤散6份，每份1.50g，置于锥形瓶中，分别加入浓度为0.20mg·mL-1的三七皂苷 R1、人参皂苷 Rb1、Coelonin、薯蓣皂苷和茯苓酸标准对照品单体溶液4.00mL、11.50mL、0.30mL、1.90mL、0.86mL，按 2.2.2项制备方法制备成6份溶液备用，按2.1项色谱条件分别进样，进样量为10μL，记录各色谱峰面积，计算各成分含量。样品回收率（%）＝（测得量－样品含量）/加样量×100%。

2.9 样品含量测定 分别精密称取4个不同购买批次的新麦纤散每批各3份，每份3.00g，按2.2.2项制备方法制备样品溶液，按2.1项色谱条件分别进样，进样量为10μL，并记录三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Coelonin、薯蓣皂苷和茯苓酸的峰面积，计算各成分的含量。

3 结果

3.1 专属性实验 结果显示样品溶液色谱图中出现与标准对照品混合溶液色谱图中保留时间相一致的特征峰，分别为三七皂苷 R1、人参皂苷 Rb1、Coelonin、薯蓣皂苷、茯苓酸，而阴性样品无此特征峰，表明其他组分对所测组分无干扰。该项实验证实本方法专属性良好。见图1、2。

图1 标准对照品混合和新麦纤散样品RP-HPLC结果Fig.1 RP-HPLC of mixing standard substance and new Maixiansan sample

图2 阴性样品RP-HPLC图Fig.2 RP-HPLC of negative sample

3.2 标准曲线与线性关系考察 分别以质量浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y绘制标准曲线，得回归方程，结果见表2。该项实验证实三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Coelonin、薯蓣皂苷和茯苓酸的线性关系良好。

表2 标准曲线与线性关系考察结果Tab.2 Results of standard curve and linear relationship

3.3 精密度实验 计算得三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Coelonin、薯蓣皂苷和茯苓酸峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为 1.12%、1.03%、0.98%、0.74%和0.77%。该项实验证实仪器精密度良好，RSD均不大于2%[9]。

3.4 重复性实验 8次重复测定新麦纤散5种成分含量，结果见表3。该项实验证实该方法重复性良好（RSD不大于2%）[9]。

3.5 稳定性实验 结果显示三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Coelonin、薯蓣皂苷和茯苓酸的峰面积RSD分别为：0.8662%、0.3481%、0.4402%、0.7065%、0.4756%。该项实验证实新麦纤散样品溶液在24h内基本稳定（RSD不大于2%）[9]。

3.6 加样回收率实验 三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Coelonin、薯蓣皂苷、茯苓酸的平均加样回收率结果见表4。各成分回收率RSD值分别为1.27%、0.54%、0.53%、1.48%和0.81%，结果表明该方法准确度良好（RSD不大于2%）[9]。

表3 重复性实验结果（n=8）Tab.3 Results of repetitive test(n=8)

4 讨论

麦纤散是一种可以更好保护肠黏膜屏障，更有效改善肠道菌群结构和肠道微环境的中药复方制剂[1]，新麦纤散则在此基础上新增三七、白及，可更有效地

表4 三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Coelonin、薯蓣皂苷、茯苓酸的平均加样回收率（n=6）Tab.4 Sample recovery results of panax notoginseng saponins R1,ginsenoside Rb1,Coelonin,diosgenin and poria acid(n=6)

3.7 样品含量的测定 结果显示麦芽纤维与不同批次的山药、茯苓、三七、白及组成的新麦纤散中三七针对溃疡性结肠炎脾虚为本，瘀毒为标的中医病机。方中麦芽纤维可有效调整肠道免疫反应，增强肠道黏膜屏障功能，使黏膜的炎症得以缓解[10]。三七具有免疫调节与抗炎活性，可对炎性反应发生的多个环节，多种炎性介质产生影响[11]。此外，三七皂苷能升高炎性细胞内游离钙的水平，降低磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）的活性，且能够有效地释放地诺前列酮从而达到抗炎作用[12]。李季委等[13]研究了薯蓣皂苷对溃疡性结肠炎的作用，结果表明薯蓣皂苷能够治疗老年慢性溃疡性结肠炎，具有一定的抗炎作用。黄斯等[14]发现茯苓酸对皮肤、口腔、耳道等局部炎症有显著抗炎作用。现代医学研究表明白及有止血、抗炎、抗肿瘤、促进创伤愈合及细胞生长等作用[15]。全方五种药物相互配伍，达到健脾固肠，止血愈疡之效。

表5 不同批次新麦纤散含量测定结果Tab.5 Results of four different batches of new Maixiansan content determination

虽然有文献报道用高效液相色谱法分别测定三七中三七皂苷R1与人参皂苷Rb1[5]、白及中Coelonin[6]、山药中薯蓣皂苷[7]和茯苓中茯苓酸的含量[8]，但由于提取条件及液相条件的限制，只能研究一种中药中单一或少数成分，尚不能同时分析以上5种成分。目前文献中关于麦芽纤维有效成分的液相色谱研究报道较少，而且缺少标准对照品，故本研究未做测定分析。笔者在前期实验中发现，提取条件中提取溶剂、提取方法和提取时间对新麦纤散中三七皂苷R1、皂苷R1、人参皂苷Rb1、Coelonin、薯蓣皂苷和茯苓酸的含量很接近，结果见表5。人参皂苷Rb1、薯蓣皂苷、茯苓酸和Coelonin的含量测定有一定的影响。在选择提取溶剂时，笔者曾采用甲醇、甲醇-水（9:1）、甲醇-水（5:5）、乙醇、乙醇-水（9:1）、乙醇-水（5:5）几种不同的溶剂组合，结果显示甲醇提取效果最好，提取有效成分更多，且操作简便。在实验过程中笔者还发现，以甲醇作为提取溶剂并经过超声处理能够进一步提高提取效率，而甲醇的体积、超声处理时间及提取次数对提取效果也有一定的影响，先加60mL甲醇超声处理1h后过滤，滤渣再加30mL甲醇再次超声处理1h能够提取大量有效成分，这样提取效率最高。因此笔者最终以甲醇为提取溶剂，超声处理2次，每次1h，用于新麦纤散样品的提取。

由于新麦纤散制剂中的药物性味较多，其有效成分中三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、薯蓣皂苷属于皂苷类化合物，茯苓酸属于三萜类化合物、Coelonin则属于菲类化合物，各成分之间存在一定的干扰，采用单一化合物的流动相体系无法满足5种待测成分同时分离测定的要求。在前期实验过程中，笔者考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液等流动相体系，结果表明单一流动相各物质分离效果不太理想，待测成分之间或待测成分与杂质成分之间不能良好分离甚至无法分离。当流动相中的有机相为甲醇时，会出现基线不稳、漂移等情况。经过多次实验发现，以乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相，梯度洗脱三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、薯蓣皂苷、茯苓酸和Coelonin的分离效果较好。

本研究建立的RP-HPLC法可同时测定新麦纤散中5种有效成分的含量，通过对4个批次药物中5种有效成分含量的测定，发现不同批次的药材中以上成分含量相差不大，并可较全面的反映市面上组成新麦纤散的药材中成分的含量。本实验建立的方法与单独测定某种成分含量的方法相比更简便、快捷；且灵敏度高、选择性好、能同时分析多种成分，可作为新麦纤散质量评价方法之一，为新麦纤散质量控制提供实验依据，并为今后新麦纤散药效学及药代动力学研究打下一定基础，具有较重要的意义。

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