黄芪水提液对老年大鼠膀胱功能及组织学的影响

浙江中医药大学附属第二医院 杭州 310005

我国人口老龄化问题日益突出，老年人尿路症状发生率不断上升。流行病学调查显示，下尿路症状（lower urinary tract symptoms,LUTS）发生率在老年人群中高达40%以上[1-2]，衰老所致的膀胱功能障碍是LUTS发生的重要危险因素[3]。衰老是膀胱功能异常的病理生理基础，衰老膀胱的能量代谢、血流循环、胆碱能受体功能及胶原蛋白含量均发生了改变[4]，因此老年人更容易出现膀胱功能障碍。黄芪（Astragalus mongholicus Bunge）为豆科多年生草本植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，临床常用于防治免疫功能紊乱性疾病、心脑血管疾病、衰老等多种疾病，疗效确切且副作用较少[5]。钟灵等[6]研究发现黄芪多糖可通过增强机体免疫功能、提高机体抗氧化能力和直接清除自由基等发挥延缓衰老的作用。本研究以老年大鼠为研究对象，探讨黄芪水提液对老年大鼠膀胱功能的影响，为临床应用提供依据。。

1 材料与方法

1.1 实验动物和饲养条件 雄性SPF级SD大鼠，3月龄10只，15月龄50只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司[实验动物生产许可证号：SYXK（沪）2013-0016]，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2013-0184]。饲养条件：温度（24±2）℃，湿度 50%～70%，采用 12h:12h昼夜间断照明。每天添加饲料1次，换水2次，更换垫料2次。动物自由进食、饮水。

1.2 主要仪器 MedLab生物信号采集器购于南京美易生物科技有限公司，测压导管由带接头的连续硬膜外麻醉导管改造而成；电动玻璃匀浆机为宁波新芝科器研究所产品；光学显微镜为日本尼康公司产品。

1.3 主要药品及试剂 生黄芪选用蒙古黄芪，购自杭州胡庆余堂（批号：20061118）；维生素C片购自四川依科制药有限公司（批号：H42020614）；维生素E软胶囊购自浙江医药股份有限公司（批号：H22022955）。Masson三色染色液为南京凯基生物有限公司产品（批号：1111254681F）；20%乌拉坦购于杭州碧云天生物科技有限公司（批号：20080610）。

1.4 实验药物制备

1.4.1 黄芪水提液的制备 蒙古黄芪用干燥箱烘干24h，高速碎机粉碎后，过120目筛，制备成极细的黄芪粉末；以水作为溶剂进行浸提，浸提条件为90℃、30min，然后冷却至室温，过滤。滤液以5 000转/min离心 10min，取上清液，调整生药浓度为 0.4g·mL-1，放置4℃冰箱待用。

1.4.2 维生素E-C混悬液的制备 将维生素C片研碎，每150mg维生素C片和150mg维生素E混合溶解于1 000mL蒸馏水中，匀浆制成混悬液。

1.5 方法

1.5.1 分组与给药 3月龄大鼠10只设为青年组（A）。15月龄自然衰老大鼠50只按数字编号，采用随机对照表法随机分为老年组（B）、维生素E-C混悬液组（C）、黄芪水提液低剂量组（D）、黄芪水提液中剂量组（E）、黄芪水提液高剂量组（F），每组10只。青年组和老年组大鼠均给予0.9%氯化钠溶液（20mL·kg-1）灌胃，1次/d，连续6周。临床上体重60kg成人黄芪常用量为9～30g，最高剂量可达到90g，根据实验动物学及中药药理学，大鼠用药剂量按照60kg成人用量的6.3倍进行计算，黄芪水提液低、中、高剂量组分别给予2g·kg-1、4g·kg-1、8g·kg-1灌胃；维生素 E-C 混悬液组则给予维生素E-C混悬液（5mg·kg-1）灌胃，均为1次/d，连续6周。

1.5.2 大鼠膀胱内压与膀胱容量测定 参照邝兆进[7]的实验方法进行。具体如下：大鼠用20%乌拉坦溶液（0.5mL·100g-1）腹腔注射麻醉后，沿下腹正中线切开皮肤和肌肉，暴露膀胱。以湿润棉花稍加固定，用眼科镊子轻提膀胱，用4.5号头皮针针头在膀胱顶部刺一小孔，然后用1号线将针头稍加固定，并与三通管的一路相连，三通管的另两路分别连接压力换能器和注射泵，整个系统用0.9%氯化钠溶液密闭。打开MedLab生物信号采集器，记录膀胱基础内压（bladder basal pressures，BP)，随后开启注射泵，按 0.2mL·min-1持续泵入0.9%氯化钠溶液并记录压力变化。排尿时，停止泵入0.9%氯化钠溶液，液体溢出时记录的膀胱压即为膀胱漏尿点压（bladder leak point pressures，BLPP），同时收集排尿量（urination volume，UV），待排尿结束后，用注射器抽空膀胱内残余尿量（residual urine volume,RUV），最后可计算最大膀胱容量（total urine volume,TUV）,TUV=UV+RUV。排空膀胱，再次灌注至膀胱最大容量一半时，用手指缓缓按压大鼠上腹部使腹压逐渐上升，观察有无尿液从尿道外口溢出，若有尿液溢出，此时记录的膀胱压即为腹压漏尿点压（abdomen leak point pressure，ALPP）。见图 1、图2。

1.5.3 大鼠膀胱组织Masson染色 待测压结束后，立即处死大鼠，剪取膀胱组织，采用预冷0.9%氯化钠溶液冲洗后，浸泡于4%多聚甲醛中保存。常规石蜡包埋、切片、脱蜡至水。在载玻片上滴加1滴苏木素染色液（试剂A），常温下染色7min，蒸馏水冲掉染液。滴加1滴复合染色液（试剂B），常温下染色5min，蒸馏水冲洗掉染液。滴加1滴磷钼酸（试剂C），常温下染色1min，蒸馏水冲洗掉染液。滴加1滴亮绿染色液（试剂D），染色10s后用蒸馏水冲洗。最后将玻片放入60℃烘箱中烘干，中性树胶封片，倒置显微镜下观察。每张切片随机选取5个视野，通过IPP6.0计算机图像分析系统，测出每个视野胶原纤维所占的面积百分比，5个视野面积百分比的平均值为该组织切片胶原纤维所占的面积百分比，即胶原纤维占比。

图1 BLPP测定曲线图Fig.1 Bladder pressure leak point pressure curve

图2 ALPP测定曲线图Fig.2 Abdominal pressure leak point pressure curve

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示；两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，差异有统计学意义时采用LSD-t检验进一步两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠膀胱容量的比较 灌胃6周后，与青年组相比，老年组大鼠RUV和TUV明显增加（P＜0.05）。与老年组大鼠相比，维生素E-C混悬液组和黄芪水提液各剂量组大鼠RUV明显减少，而TUV明显增加（P＜0.05，P＜0.01）；其中黄芪水提液各剂量组作用存在剂量依赖性，与老年组相比，高剂量组变化最明显，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见图3。

2.2 各组大鼠膀胱压力的比较 灌胃6周后，与青年组相比，老年组大鼠BLPP、ALPP明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与老年组比较，维生素EC混悬液组和黄芪水提液各剂量组BLPP、ALPP显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

2.3 各组大鼠膀胱组织纤维化情况的比较 Masson染色镜下观察可见，青年组大鼠逼尿肌排列整齐，胶原纤维（深染部分）较少。与青年组相比，老年组大鼠膀胱组织中逼尿肌纤维排列紊乱，松散，胶原纤维占比明显增加（P＜0.05）；与老年组相比，黄芪水提液中剂量组和高剂量组的膀胱组织胶原纤维占比减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图5、表1。

图3 各组大鼠膀胱残余尿及总尿量的比较Fig.3 Comparison of residual urine and total urine volume in each group

图4 各组大鼠膀胱BLPP及ALPP的比较Fig.4 Comparison of BLPP and ALPP in each group

3 讨论

引发老年人排尿功能改变的因素除了神经、血管系统病变和膀胱流出道梗阻外，衰老本身也是重要因素之一[8]。研究证实，膀胱功能改变与年龄密切相关，老年人群（年龄＞60岁）膀胱容量较青年人群（年龄＜40岁）明显增加，而膀胱逼尿肌收缩功能和漏尿点压力明显降低[9]。本研究中老年组大鼠膀胱TUV和RUV均较青年组显著增加，提示老年大鼠存在膀胱排空功能障碍。引起这一变化最常见的原因是逼尿肌收缩能力和膀胱容量敏感性的降低。Smith等[10-11]通过临床观察发现患者晨起第一次排尿量随着年龄的增加而逐渐增加，进一步印证了衰老与膀胱容量敏感性降低相关。本实验中同时观察到大鼠膀胱内压随着年龄的增加而降低，提示老年大鼠膀胱逼尿肌收缩功能的下降。衰老还可导致膀胱组织结构发生改变，如Zhao等[12]研究发现老年大鼠膀胱逼尿肌收缩功能的下降与膀胱壁组织中平滑肌成分的比例降低及胶原成分比例提高相关。本研究也发现，老年组大鼠膀胱组织中胶原纤维占比较青年组明显增加。平滑肌/胶原比例失衡，可能是引起老年大鼠膀胱功能障碍的结构基础。衰老导致膀胱结构和功能的改变潜在机制复杂，受到遗传、环境等多因素的影响，仍需进一步深入研究。

维生素C和维生素E分别是水溶性和脂溶性的抗氧化维生素，具有较强的抗氧化作用，能发挥独特的抗衰老功效[13]。动物实验证实，维生素C和维生素E联合使用可明显增加大鼠肝脏和肌肉中过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶的活性，而且效果比两者单独作用更显著[14]。维生素C和维生素E对于膀胱衰老的干预也有研究报道，维生素E在早期糖尿病大鼠膀胱氧化性损伤中能够发挥抗氧化作用[15]，并能增加老年大鼠膀胱组织中还原型谷胱甘肽水平，也能对膀胱功能起到保护作用[16]。本研究中发现，两者合用虽然不能显著改善老年大鼠膀胱组织纤维化，但是能显著增加老年大鼠膀胱内压，提高膀胱逼尿肌的收缩功能，进而减少膀胱残余尿量，改善排尿功能。

图5 各组大鼠膀胱组织纤维化情况的比较（Masson染色，100×）Fig.5 Comparison of fibrosis of bladder tissue in each group（Masson staining 100×）

表1 黄芪水提液对大鼠膀胱组织胶原纤维占比的影响（%）Tab.1 Effect of Astragalus aqueous extract on histology of bladder detrusor in rats(%)

祖国医学宝库中有许多具有抗衰老作用的药材，黄芪作为名贵的补益药，其药效已获得广泛的认同。动物实验从不同角度证实了黄芪提取物及其有效成分具有抗氧化，抗氧自由基损伤的作用，从而延缓机体器官衰老[17-18]。另外，黄芪能够调节 p16、Bcl-2、FasL等基因的表达，从而抑制细胞凋亡，保护细胞功能，延缓衰老[19-20]。冯建华等[21]采用黄芪干预糖尿病大鼠模型，证实其对糖尿病大鼠膀胱功能具有保护作用。黄芪水提液制备简单，其中起到抗衰老作用的主要是水溶性的黄芪多糖、黄酮、皂苷等成分[22]。杨小虎等[23]采用体外实验证实黄芪水提液具有良好的自由基清除效果，以达到抗衰老功效。本研究中黄芪以成人临床常用剂量范围做参考，根据实验动物学及中药药理学换算成3个不同剂量组进行大鼠给药，结果发现不同剂量黄芪水提液均能降低老年大鼠残余尿量，增加膀胱BLPP和ALPP，除低剂量组外均能降低膀胱组织胶原纤维占比，抑制纤维化，进而提高膀胱逼尿肌收缩功能，改善排尿功能。

综上所述，本研究发现黄芪水提液对衰老所致膀胱功能障碍有明显改善作用，今后笔者将就黄芪改善老年膀胱功能的机制进一步深入研究，为中药黄芪防治膀胱功能障碍提供新的理论依据。

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