痞痛舒降低内脏高敏感治疗功能性消化不良的研究

智屹惠沈炜王坤根林友宝黄立权沈淑华孙洁蔡利军

1.浙江中医药大学附属第一医院杭州310006 2.浙江中医药大学附属第二医院

功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）是指存在一种或多种消化不良症状，经检查可排除引起上述症状的器质性疾病的一组临床综合征[1]。根据罗马Ⅲ的诊断标准，西方国家FD的人群发病率高达11%，我国发病率为23.5%[2]。虽然FD不威胁患者生命，但严重影响患者的生活质量，每年耗费大量的医疗资源[3]。由于FD患者在治疗过程中容易出现安慰剂效应，因此现代医学的疗效并不令人满意。

现有研究表明，内脏高敏感是FD发病的重要机制[4]。肥大细胞（mast cells，MC）活化与内脏高敏感的外周致敏机制关系密切，而c-fos基因表达增加和细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）磷酸化水平增高对于内脏高敏感的中枢敏感化形成至关重要[5]。痞痛舒是导师王坤根治疗FD的经验方，由柴胡、白芍、苍术、厚朴、元胡、甘草组成，具有良好的临床疗效。笔者前期动物实验发现，痞痛舒能够促进小鼠胃排空、增强胃肠动力。本研究拟对FD大鼠模型给予痞痛舒治疗，观察其对胃黏膜组织MC活化、脊髓背角c-fos基因和蛋白表达及对ERK磷酸化水平的影响，来探讨痞痛舒治疗FD的部分可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 10d龄清洁级SD大鼠100只，雌雄各半，体质量约20g，购于上海斯莱克实验动物有限公司 [许可证号：SCXK(沪)2012-0002]，20d 龄前母乳喂养，20d龄开始予常规饲料喂养。所有大鼠均饲养于杭州赫贝屏障级动物实验中心的独立通气笼具（individual ventilated cages，IVE）中[许可证号：SYXK（浙）2012-0178]。相对湿度50%～70%，温度（22±1）℃，12h明暗交替，换风次数 15～20 次/h，噪音低于50dB。

1.2 主要药品和试剂 痞痛舒（柴胡、白芍、苍术、厚朴、元胡、甘草）由浙江中医药大学附属第一医院制剂室提供，用8倍量纯化水煎煮两次，每次1h，合并滤液，常压浓缩至每毫升含生药材2g，制成痞痛舒流浸膏备用。c-fos抗体购于艾博抗（上海）贸易有限公司（批号：GR27488），工作浓度 1:300；兔抗羊二抗购于艾博抗（上海）贸易有限公司（批号：GR1878-25），工作浓度1:500；p44/42丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPKs）（ERK1/2）兔单克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology公司（批号：4695S）；磷酸化 p44/42 MAPK（ERK1/2）兔单克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology公司（批号：4377S）；羊抗兔IgG（H+L）HRP购于美国Bioworld Technology 公司 （批号：BS13278）；RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit购于加拿大Fermentas公司（批号：00161002）；qPCR 试剂 SuperReal Premix Plux（with SYBR Green I）购于天根生化科技(北京)有限公司（批号：#N2217）；ECL Plus发光试剂盒（批号：1408105）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF，批号：1407230）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号：0580582）均购于上海碧云天生物技术有限公司；碘乙酰胺购于上海紫一试剂厂（批号：ZY140215）；DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司（批号：K146708C）；DNA/RNA/蛋白共提取试剂盒为美国Omega Bio-Tek公司产品（货号：R6734-01；批号：00R6734010000A23N018）；彩色预染蛋白分子量标准购于加拿大Fermentas公司；PVDF膜购于美国Millipore公司。

1.3 主要仪器 BL-420F机能实验系统购于成都泰盟科技有限公司；乳胶气囊（2.5cm×2.0cm）和聚乙烯导管 （10.0cm×0.2cm） 为自制；Mini-Proten Tetra System电泳系统购于美国Bio-RAD公司；SPECTRA max Plus 384酶标仪购于美国Molecular Devices公司；超高灵敏度化学发光成像系统（ChemiDoC XRS+）购于美国Bio-RAD公司；tec 2500型病理组织漂烘仪为常州市郝思琳仪器设备有限公司产品；H1650R台式高速冷冻离心机购于上海卢湘仪离心机仪器有限公司；BX43型显微镜为日本Olympus公司产品。

1.4 方法

1.4.1 造模 简单随机法选取80只10d龄乳大鼠造模，每只乳大鼠予0.2mL含0.1%碘乙酰胺的2%蔗糖溶液灌胃，1次/d，连续6d。另外20只作为正常对照组，予等体积2%蔗糖溶液灌胃，1次/d。所有大鼠常规喂养至第 56 日[5]。

1.4.2 分组与给药 第57日时，将造模大鼠按随机数字表法分为模型组、痞痛舒高剂量组、痞痛舒中剂量组、痞痛舒低剂量组。自第57日起，按照大鼠体表面积系数，将痞痛舒临床剂量换算为等效剂量：痞痛舒低剂量组按生药量228mg/（kg·d）剂量予痞痛舒流浸膏灌胃，中剂量组按325mg/（kg·d）剂量灌胃，高剂量组按464mg/（kg·d）剂量灌胃。正常对照组及模型组予等体积的纯化水灌胃。连续给药28d后检测指标。给药第28日,每组各随机选取6只大鼠检测胃肌电图（electromyography，EMG），剩余大鼠断头法处死后按要求获取标本。

1.4.3 EMG检测 大鼠术前禁食不禁水过夜，第2日在无菌条件下进行所有手术操作。大鼠仰卧固定，予80mg·kg-1氯胺酮和7mg·kg-1甲苯噻嗪腹腔注射麻醉，从胃底作一切口，植入一个带导管的乳胶球囊（球囊长2.5cm），球囊位置应不阻塞幽门，且不妨碍胃排空。紧密缝合切口以防止胃液进入腹腔，然后逐层缝合腹腔和皮肤。将球囊的充气导管和EMG电极导线一起外置于大鼠颈背部，以绝缘的40号聚四氟乙烯无菌不锈钢线置入斜方肌，肌肉和切口以4-0丝线缝合。术后1周，将上述大鼠分别置于塑料大鼠限制笼中适应1h，球囊导管与血压计连接，20s内向球囊注气，使胃内压达到40mmHg，休息5min后行EMG检测。EMG基线信号以及胃恒压扩张时的EMG信号由低噪音的AC放大器扩增，使用CED 1401/SPIKE2程序数字化并集成。

1.4.4 胃组织HE染色 大鼠快速断头法处死，迅速切取近端胃，用0.9%氯化钠溶液冲去粘附的分泌物及血液，福尔马林固定，制作石蜡切片。切片脱蜡复水后行HE染色，脱水透明，中性树胶封固，200倍光镜下观察形态学结果。

1.4.5 胃组织甲苯胺蓝染色 标本处理及石蜡切片制作同1.4.4项。切片脱蜡复水后1%甲苯胺蓝染液染色30min，水洗，冰醋酸分化，直至细胞核和颗粒清晰。水洗后冷风吹干；透明后中性树胶封固。200倍光镜下每张切片随机选择3个不同视野，对胃组织MC进行计数，结果以每高倍视野MC个数表示。

1.4.6 免疫组化检测大鼠脊髓背角c-fos蛋白表达情况 大鼠快速断头法处死，小心取出T8-9脊髓，迅速切取脊髓背角，沿中线分成两份，一部分福尔马林固定，制作石蜡切片，其余部分于-80℃冰箱保存，准备行Western blot和Real-time RT-PCR检测。切片脱蜡复水后，37℃下加入3%H2O2孵育10min，微波修复，一抗4℃冰箱孵育过夜（磷酸盐缓冲液为阴性对照），室温平衡30min后加入二抗，37℃孵育 30min，DAB显色，显微镜下观察。自来水充分冲洗，苏木素染液复染，干燥后封片并拍照。200倍光镜下观察，每张切片随机选择3个不同的视野，判读视野中阳性细胞染色强度和阳性细胞百分比。染色强度的最终计分为大部分细胞呈现的染色强度计分减去背景着色计分：0分为无明显着色，1分为轻微黄色或淡黄色，2分为棕黄色或深黄色，3分为黑褐色或棕褐色。阳性细胞百分比=每视野阳性细胞数/每视野细胞总数×100%，阳性细胞百分比最终计分如下：0～5%为0分，6%～25%为 1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%均为4分。染色结果判定采用半定量方法，阳性得分为染色强度计分与阳性细胞百分比计分的乘积：0分为阴性，1～6分为弱阳性，7～12分为强阳性。

1.4.7 Real-time RT-PCR检测大鼠脊髓背角c-fos mRNA表达情况 大鼠脊髓标本采集和处理同1.4.6项。DNA/RNA/蛋白共提取试剂盒提取组织总RNA；测定RNA纯度并判断质量；cDNA合成，-20℃保存备用。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。大鼠c-fos正向引物：5’-GAAGGAAAGGAATAA-3’；反向：5’-TTGGCAATCTCGGTCT-3’。内参序列：大鼠Actin正向引物：5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，反向：5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。 反 应 体 系 ：IQ SYBR Green Supermix 10μL、10μmol·L-1正向引物 1 μL、10μmol·L-1反向引物 1μL、cDNA（加水稀释成一致水平）8μL。反应参数：50℃ 3min；95℃ 15min；95℃10s；54℃ 20s；70℃ 15s。模板变形、退火、延伸重复 40个循环。熔解温度：70℃～95℃。mRNA相对表达量计算采用比较Ct值法（2-△△Ct法），由荧光定量PCR分析软件BIO-RAD CFX Manager自动进行计算和统计。

1.4.8 Western blot检测大鼠脊髓背角ERK1/2与磷酸化 ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，pERK1/2）蛋白表达 标本采集和处理同1.4.6项。取适量组织匀浆，PMSF裂解液提取总蛋白，置于-80℃保存；BCA法测定蛋白浓度；配制10%分离胶和5%浓缩胶，上样量为每泳道30μg，电泳转膜后5%脱脂奶粉室温封闭过夜；一抗室温孵育2h；二抗室温孵育1h；化学光敏模式曝光显影；Image J软件分析照片中各条带的光密度。ERK1/2磷酸化水平以pERK1/2与ERK1/2的比值表示。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析。计量资料用±s表示，组间两两比较采用最小显著差异法（LSD-t）进行，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验大鼠一般情况 造模初期，正常对照组乳大鼠因灌胃死亡3只，造模的80只中因灌胃死亡18只。最终正常对照组存活大鼠17只，模型组和痞痛舒低剂量组各15只，痞痛舒中、高剂量组各16只，各组存活大鼠生长良好，反应灵敏。造模后各组大鼠自发活动增多，进食减少，但组间体质量无统计学差异（P＞0.05）。痞痛舒给药期间各组大鼠未发生死亡，给药后各组大鼠体质量增加，给药结束后各组间体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 大鼠FD模型的建立 在40mmHg胃扩张压力下，模型组大鼠EMG的振幅较正常对照组增加。见图1。HE染色显示，正常对照组胃组织无炎症改变，而模型组胃黏膜可见轻度慢性炎症改变。见图2。本研究采用碘乙酰胺法建立FD大鼠模型，与文献报道一致[6]。碘乙酰胺可以引起乳鼠成年后内脏高敏感，而胃黏膜组织仅有轻度慢性炎症改变，上述结果说明大鼠FD模型建立成功。

图1 40mmHg压力扩张后大鼠EMGFig.1 The gastric electromyography when expansion pressure was 40mmHg

图2 大鼠胃组织炎症情况（HE染色，200×）Fig.2 Inflammation of gastric tissue in rats(HE staining,200×）

2.3 各组大鼠胃组织MC观察与计数 胃组织甲苯胺蓝染色显示，正常对照组MC主要分布在黏膜下层，肌层及黏膜层未见；模型组除黏膜下层外，肌层亦可见较多的MC。痞痛舒各剂量组肌层、黏膜下层可见少量MC。其中，痞痛舒高剂量组和中剂量组部分视野黏膜下层仍可见较多的MC。MC计数：模型组MC数量明显高于正常对照组（P＜0.05）。痞痛舒各剂量组与模型组相比较，MC数明显减少（P＜0.05）；痞痛舒各剂量组组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1、图 3。

表1 各组大鼠胃组织MC观察与计数(±s，n=6)Tab.1 Observation and counting of mast cells in gastric mucosa of rats in each group(±s，n=6)

表1 各组大鼠胃组织MC观察与计数(±s，n=6)Tab.1 Observation and counting of mast cells in gastric mucosa of rats in each group(±s，n=6)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,#P＜0.05.

图3 各组大鼠胃组织MC观察（甲苯胺蓝染色，200×）Fig.3 Observation of gastric tissue MC by light microscope(toluidine blue staining,200×)

2.4 免疫组化检测各组大鼠脊髓背角c-fos蛋白表达水平 模型组脊髓背角c-fos阳性得分明显高于正常对照组（P＜0.05）；痞痛舒各剂量组c-fos阳性得分均低于模型组，其中痞痛舒高剂量组与模型组比较差异具有统计学意义（P＜0.05），而痞痛舒中、低剂量组与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。痞痛舒各剂量组组间比较，差异也无统计学意义（P＞0.05）。见表 2、图 4。

表2 各组大鼠脊髓背角c-fos蛋白表达水平(±s，n=6)Tab.2 Expression of c-fos protein in dorsal horn of spinal cord in rats(±s，n=6)

表2 各组大鼠脊髓背角c-fos蛋白表达水平(±s，n=6)Tab.2 Expression of c-fos protein in dorsal horn of spinal cord in rats(±s，n=6)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,#P＜0.05.

图4 各组大鼠脊髓背角c-fos蛋白表达（免疫组化，200×）Fig.4 Expression of c-fos protein in dorsal horn of spinal cord in rats(Immunohistochemistry,200×)

2.5 Real time RT-PCR检测各组大鼠脊髓背角cfos mRNA表达水平 模型组脊髓背角c-fos mRNA相对表达量高于正常对照组（P＜0.05）。痞痛舒各剂量组中，低剂量组c-fos mRNA相对表达量与模型组相近，而中、高剂量组c-fos mRNA相对表达量明显低于模型组和低剂量组（P＜0.05）。正常对照组与痞痛舒中、高剂量组之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠脊髓背角c-fos mRNA表达水平(±s，n=6)Tab.3 Expression of c-fos mRNA in dorsal horn of spinal cord in rats(±s，n=6)

表3 各组大鼠脊髓背角c-fos mRNA表达水平(±s，n=6)Tab.3 Expression of c-fos mRNA in dorsal horn of spinal cord in rats(±s，n=6)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与痞痛舒低剂量组比较，△P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,#P＜0.05;compared with Pitongshu low dose group,△P＜0.05.

2.6 Western blot检测各组大鼠脊髓背角ERK1/2与磷酸化ERK1/2蛋白表达 各组间ERK1/2蛋白表达无明显差异（P＞0.05）。正常对照组ERK1/2磷酸化水平（pERK1/2与ERK1/2的比值）与模型组、痞痛舒低剂量组无明显差异（P＞0.05），痞痛舒中、高剂量组ERK1/2磷酸化水平低于低剂量组、正常对照组与模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；但痞痛舒中、高剂量组组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5及表4。

图5 各组大鼠脊髓背角ERK1/2与pERK1/2蛋白表达Fig.5 Expression of ERK and pERK1/2 protein in dorsal horn of spinal cord in rats

表4 各组大鼠脊髓背角ERK1/2蛋白磷酸化水平(±s，n=6)Tab.4 The phosphorylation of ERK1/2 protein in spinal dorsal horn in rats(±s，n=6)

表4 各组大鼠脊髓背角ERK1/2蛋白磷酸化水平(±s，n=6)Tab.4 The phosphorylation of ERK1/2 protein in spinal dorsal horn in rats(±s，n=6)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与痞痛舒低剂量组比较，△P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,#P＜0.05;compared with Pitongshu low dose group,△P＜0.05.

3 讨论

FD的主要病理机制为胃肠动力障碍和内脏高敏感[4]。内脏高敏感通常表现为肠道对化学性刺激以及机械扩张阈值降低[7]。内脏高敏感包括外周致敏和中枢致敏两方面机制，主要表现为外周和中枢神经元的自发性活性增强，兴奋性提高[8]。

MC在内脏高敏感的外周致敏机制中有重要的作用。人胃肠道黏膜中的MC有47%～77%与神经纤维伴行。受到外界刺激或者感染的情况下，MC被激活，发生脱颗粒，释放多种因子，如组胺、一氧化氮（nitric oxide，NO）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、类胰蛋白酶等。其中组胺、NO等作用于胃肠平滑肌受体，导致胃肠道功能紊乱；5-HT、类胰蛋白酶作用于胃黏膜初级神经末梢受体，使胃肠道与中枢神经投射敏感性增加，从而产生内脏高敏感[9]。研究证实，减低黏膜MC数量并抑制其脱颗粒，可改善患者早饱、餐后不适、上腹痛、上腹烧灼感等症状[10]。所以，本实验选用MC作为观察内脏高敏感的外周致敏机制的主要指标。

中枢致敏机制被认为是内脏高敏感的关键因素。c-fos是原癌基因，参与细胞生长和生化调节。其基础表达非常低，但受到刺激后c-fos基因可在几分钟之内被激活，转录为mRNA，30min内达到高峰，而c-fos蛋白的表达大大延迟，刺激后30min才开始表达[5]。c-fos在中枢神经系统中起着第三信使的作用[11]，被认为是各种刺激的共同效应因子，也在神经可塑性和记忆结构转化中起着重要的作用，被常用作为神经元功能-形态的标志。

ERK1/2是MAPKs中的一种，参与将细胞外信号向细胞内传导的过程，调节细胞内基因表达，如cfos、c-Jun等。pERK是磷酸化的ERK，通过信号级联通路Ras-Raf-MEK-ERK途径激活，其表达水平可代表ERK1/2通路的激活程度。近年研究发现ERK参与神经可塑性改变和痛觉过敏。pERK可被作为神经元伤害刺激后的活动标志物。与c-fos表达相比较，受到刺激后pERK表达更为迅速，1min内开始增加，2～5min 表达达到高峰[5]。

脊髓背角是内脏感觉的关键部位，会聚内脏感觉传入神经[12]，也是中枢神经下行调节的通路。慢性有害性内脏刺激可使脊髓背角神经元发生可塑性改变，神经元兴奋性持续存在，这一点被认为是内脏高敏感的中枢致敏机制的中心环节[13]。所以，本实验选用脊髓背角的c-fos及其上游的ERK1/2磷酸化水平作为内脏高敏感的中枢致敏机制的主要观察指标。

痞痛舒是导师王坤根总结其50余年临床经验提炼出的治疗FD的基本方。王师认为FD的病位主要涉及脾胃、肝胆，其基本病机是肝气郁结，脾胃升降失常，进而发展为湿阻、热郁，久病多入络，伤阴耗气。治疗以疏肝和胃，运脾化湿为大法。痞痛舒方中柴胡、白芍疏肝柔肝为君；苍术、厚朴行气燥湿为臣；元胡行气活血止痛为佐，可助柴胡行气，白芍止痛；甘草调和诸药为使，合白芍既可酸甘化阴，防止疏泄太过，又可缓急止痛。本方辛散与酸收并用，益肝之体而疏肝之用，辛开苦降，斡旋中州气机。因久痛入络，故方中用行气活血之品；因脾虚湿阻，更以运脾化湿和胃安中诸药相伍，二和木土，则“痞”、“痛”自除。验之于临床，效如桴鼓。现代药理研究表明：痞痛舒方中的柴胡可明显延长热致痛小鼠热痛反应时间,显著拮抗醋酸所致的疼痛，柴胡皂苷可增强兔离体肠管蠕动[14]。白芍中的芍药苷能够减低大鼠各种伤害感受和过敏反应[15]。苍术中的β-桉叶醇在胃肠运动功能正常或低下时，能促进胃肠运动[16]。厚朴可使兔离体胃底条平滑肌的张力明显升高，对乙酰胆碱所致的十二指肠平滑肌蠕动加强有明显拮抗作用[17]。延胡索的有效成分左旋延胡索乙素对神经痛有很强的镇痛效果[18]，延胡索全碱能抑制胃酸分泌量及胃酸酸度，具有抗溃疡作用[19]。此外，总芍药苷具有抗抑郁的作用[15]，而延胡索具有抗焦虑的作用[20]。现代医学认为FD的发病与精神因素有关[21]，而笔者也认为FD的基本病机是肝气郁结，这也可能是痞痛舒的作用机制之一。

本研究中模型组的MC计数明显高于对照组，痞痛舒各剂量组胃黏膜的MC要低于模型组，说明痞痛舒能抑制胃组织中的MC数量，提示其治疗FD可能是通过内脏高敏感的外周机制起到作用。本研究还发现模型组脊髓背角的c-fos蛋白、c-fos mRNA均高于对照组，提示模型组存在中枢致敏；痞痛舒高剂量组c-fos蛋白的表达低于模型组,痞痛舒中、高剂量组c-fos mRNA的表达及ERK1/2磷酸化水平均低于模型组及痞痛舒低剂量组,差异均有统计学意义。提示痞痛舒治疗FD可能主要是通过内脏高敏感的中枢机制起到作用，并且提示痞痛舒的作用可能存在一定的量效关系。临床上患者服用的痞痛舒通常采用常规剂量，本研究的结果为临床上痞痛舒的剂量调整提供了一定的依据，但仍然需要对不同剂量的痞痛舒进行毒理学研究进一步证实。

综上所述，本研究提示痞痛舒治疗FD存在双重机制，既可以通过减少胃黏膜MC数量，减低末梢神经刺激这一外周机制，又可以通过抑制c-fos表达及pERK磷酸化，降低中枢敏感这一中枢机制。痞痛舒通过两条途径降低内脏高敏感，达到治疗FD的效果，且可能存在一定的量效关系。

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