胃蛋白酶法提取鱼腥草多糖工艺研究

杜晶　汪珊　黄传辉

【摘 要】目的：优化胃蛋白酶提取鱼腥草多糖的制备工艺。方法 以多糖含量和多糖得率为指标，才用正交试验对胃蛋白酶提取鱼腥草多糖的工艺进行优化。结果及结论：最佳工艺条件为温度50℃，pH=7，酶加入量5.0%，提取时间1.5h。鱼腥草为三白草科 Saururaceae 蕺菜属植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb的新鲜全草，具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋的功效，主要用于肺脓疡、痰热咳嗽、热痢热淋、痈疮肿毒[1]。其水溶性多糖对羟自由基和超氧自由基有较明显的清除作用[2]。但目前胃蛋白酶提取鱼腥草多糖的工艺尚未报道，因此本实验以多糖的率及含量为指标[3]，采用正交试验对鱼腥草多糖提取工艺进行优化。

【中图分类号】R284.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2018）01--01

1 仪器与试药

UV-2450紫外分光光度计（日本岛津公司）；SHB3循环水真空泵（上海申生科技有限公司）；RE-52A型旋转蒸发仪（广州市深华生物技术有限公司）；SHZ-D（III）型循环水式真空机（巩义市英峪予华有限公司）；恒温水浴锅（江苏省金坛市宏华试剂厂）；GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、AY120电子天平（日本岛津）。

葡萄糖标准品（sigma公司）；胃蛋白酶（1：3000，批号081110 广州市齐云生物生产）；苯酚、浓硫酸、氨水、95%乙醇均为分析纯，苯酚试液（自配[4]）

干品鱼腥草购于广州清平市场，经广东药学院中药鉴定教研室姬生国博士鉴定为三白草科蕺菜属植物Houttuynia cordata Thunb.。

2 方法与结果

2.1 鱼腥草多糖的提取 称取鱼腥草药材5.0g，按正交设计表条件进行提取，按照正交实验表进行试验，提取液浓缩至1：4（原料重：溶液体积），80%乙醇醇沉，静置2小时以上，抽滤，取沉淀，50度烘箱里烘干，得粗多糖[5]。

2.2 鱼腥草多糖含量测定方法的建立

2.2.1 葡萄糖标准品溶液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖0.0994g ，加水溶解并定容至 100mL，移取1ml，加水定容至10ml容量瓶中，即得浓度为0.0994mg/mL的葡萄糖对照品贮备液。

2.2.2 供试液的制备：称取鱼腥草药材5.2g，按照正交设计表进行提取，得粗多糖。精密称取于50℃烘干至衡重的粗多糖100mg，加水溶解并定容至50ml，摇匀，再取1mL定容至10mL容量瓶中，摇匀，即得。

2.2.3 标准曲线的制备：精称葡萄糖标准液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，置10mL容量瓶中加水至刻度线，摇匀，再分别取1mL，加适量苯酚溶液及浓硫酸显色45min。置分光光度计中，于490nm测定吸收度，以吸收度（A）对葡萄糖含量（C）进行回归，得回归方程：A=8.4286C-0.0258 ，相关系数γ=0.9969。结果表明葡萄糖在0.0192～0.0596mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.2.4 多糖含量的测定：取供试品溶液1mL，置于试管中，加适量苯酚及浓硫酸，振摇均匀，显色45min。另取1mL 蒸馏水 ，加同量苯酚和浓硫酸 ，同法操作 ，作为空白对照。置UV-2450型分光光度计中 ，于490nm测定吸收度。

2.2.5 多糖提取得率：称取鱼腥草药材5.2g，按正交试验表进行提取，得粗多糖。多糖得率=100%*（粗多糖的量/药材的量）。

2.2.6 蛋白质含量的测定：称取鱼腥草药材5.2g，按正交设计表进行提取，得粗多糖。精密称取于50℃烘干至衡重的粗多糖0.1000g，加水溶解并定容至50mL，摇匀。以蒸馏水为空白对照，于分光光度计中测定280nm、260nm处吸收度。根据公式求出蛋白质含量。蛋白质浓度（mg/mL）=1.45D280-0.74D260[6]

2.3 胃蛋白酶提取最佳条件优选 影响酶法提取多糖的因素主要有酶添加量、pH值、温度、时间等[7]，在单因素实验的基础上以pH=7，以40倍鱼腥草药材体积水提取多糖，对酶添加量、温度、时间等因素采用L9（34）正交试验法确定胃蛋白酶最佳提取条件。最佳提取条件要满足多糖提取率高级含量高，因此我们采用加权评分法综合评价鱼腥草多糖的提取条件。评分标准为：将各项指标除以该列最大值再乘以100，通过处理，多糖的率和多糖含量都在0至100之间。根据多糖得率（x）和多糖含量（y）的作用，而确定二者的权重系数分别为0.4、0.6对两项指标得分的加权求和，通过公式z=0.4x+0.6y，得到综合评分（z）.由正交试验及方差结果表明，胃蛋白酶提取多糖的影响因素大小顺序为：A>C>B，最佳提取条件为：A3B3C3，即ph=7，温度50℃，酶加入量5.0%，提取时间1.5h。

2.4 验证试验 按胰蛋白酶5.0%，40倍体积在pH=7，50℃温浸1.5小时的方法提取三次，进行重复试验。鱼腥草多糖得率分别为9.52%、9.90%、9.60%，RSD%=0.20。鱼腥草多糖含量分别为20.41%、22.45%、20.79%，RSD%=1.08%。表明重现性良好。

3 讨论

本实验采用单因素试验和正交试验相结合，最终确定了胃蛋白酶最佳提取鱼腥草多糖的工艺条件为以40倍药材体积水，在pH=7，温度50℃，酶加入量5.0%，提取时间1.5h。该工艺既保证了得率还提高了含量，为鱼腥草进一步研究奠定了一定的理论基础。

参考文献

中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：化学工业出版社，2005：155.

张建新.微波提取鱼腥草水溶性多糖清除自由基特性的研究[J].食品科技，2006，31（8）：115～1171.

嵇文亚，孟 江. 碱法提取鱼腥草多糖的工艺研究[J].齐鲁药事，2008，27（1）：44～46.

余世春，徐金龙，汪海孙，等.苯酚-硫酸法测定小柴胡汤口服液多糖的含量[J].中成药，1993，15：12.

刘淑蕊等.基于BP神经网络对木瓜蛋白酶法提取鱼腥草多糖工艺的优化[J].广东药学院学报，2013，29（2）：130～133

蔡武城，衰厚积主编.生化物质常用化学分析法[M].科学出版社，1982.98

孫向军.螺旋藻多糖提取新工艺的研究[J].食品科学，2000（2）：32～34.endprint