麝香酮对大鼠创伤性脑损伤后早期MMP9蛋白表达的影响

蒋光元 罗 超 彭 形 肖 刚 滕志朋

（重庆市中医研究院，重庆 400021）

创伤性脑损伤（TBI）是一种创伤性疾病，是导致患者伤残及死亡的主要原因［1］。TBI后会发生细胞的死亡及水肿，是继发性脑损伤的重要原因之一，目前研究发现TBI后脑水肿发生与血脑屏障的破坏有着密切关系，血脑屏障的通透性改变是创伤性脑水肿发生的重要原因之一［2］。 基质金属蛋白酶-9（matrix metalloprotein 9）是基质金属蛋白酶家族中主要在脑组织中表达的一种蛋白，MMP9与脑水肿发生密切相关，它的过度表达可导致血脑屏障通透性增加，加重脑水肿的发生［3］。因此，早期预防脑水肿的发生对TBI预后有着重要的临床意义。麝香酮是中药麝香主要成分，具有醒脑开窍、通经活络、消肿止痛等功效［4］，且对血脑屏障具有保护作用，但其具体的作用机制目前研究不清楚。因此，本研究探讨麝香酮对TBI的保护作用及其醒脑开窍的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 160只雄性SD大鼠（SPF级），体质量（200±10）g，购自重庆医科大学动物实验中心［动物使用许可证号：SYXK（渝）2012-0002）］。

1.2 试药与仪器 麝香酮（规格：每支50mg，纯度≥98%，批号541913）购自上海金穗科技有限公司，用0.01 g/mL的聚山梨酯80配成0.1 mg/mL悬浊液；光学显微镜（日本 OLYMPUS），高速台式离心机（Backman CS-15R，美国Beckman公司），避暗穿梭测试仪（ZH-YLS-17B，淮北正华公司）。

1.3 造模与分组 按照简单随机化方法分为正常组、假手术组、TBI创伤组、麝香酮组（0.9 mg/kg），每组在12 h、24 h、3 d、7 d 各 10 只。麝香酮组于致伤后每天腹腔内注射麝香酮。假手术组、TBI创伤组给予等量等渗0.9%氯化钠注射液。造模前，大鼠禁食8 h；用0.07 g/mL水合氯醛腹腔注射麻醉 （0.005 mL/g），麻醉成功后，头部固定于脑立体定位仪上。于矢状缝正中切开头皮，剥离骨膜，暴露左侧顶骨，在冠状缝后1.5 mm，中线旁左侧2.5 mm处，用高速颅骨钻钻1个小孔，并扩大为直径5 mm的骨窗，保持硬脑膜完整，将“T”形撞杆置于应硬膜外，用50 g砝码从20 cm高处沿导管呈自由落体冲击力为1000 g/cm，打击后，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮，致伤动物苏醒后原笼喂养。假手术组只开骨窗。实验中死亡或瘫痪的大鼠重新造模补充。

1.4 避暗试验 大鼠避暗试验反应仪分为明、暗两室。箱底铺以铜网，在暗箱通以40 V交流电。两室之间设直径8 cm的圆孔。首先将大鼠背向洞口放入明箱，由于大鼠趋暗的特性，则钻入暗箱中，又因受电击而进入明箱。致伤后12 h、24 h，3 d、7 d进行测试，记录大鼠5 min内进入时间为潜伏期。潜伏期和错误次数反映动物的记忆水平，间接反映脑功能。

1.5 标本采集与检测 1）HE染色观察脑组织变化。各时间点大鼠用0.07 g/mL水合氯醛腹腔注射麻醉（0.005 mL/g），40 g/L多聚甲醛灌注取脑，切取以损伤灶为中心前后5min的大脑冠状切面。常规脱水、石蜡包埋、切片5～7 μm；切片在水浴锅上进行展片，再在载玻片上进行贴片；二甲苯脱蜡15 min，乙醇固定；木精液染色5 min；用蒸馏水及乙醇冲洗后，0.005 g/mL伊红染色1～3 min；二甲苯脱蜡15 min，乙醇固定；中性树胶封片。2）Westernblot检测MMP9蛋白的表达。组织经过不同处理后，提取总蛋白，并测定蛋白浓度；每孔30 μg总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，半干转至NC膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，分别一抗（14-3-3 ν，1∶1000；β-actin，1∶2000）4 ℃下孵育过夜。 TBST 漂洗后，再加HRP标记的二抗室温孵育1 h，TBST漂洗后，采用化学发光法显影。

1.6 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差（ANOVA）分析，两组均数的比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠避暗实验结果 见表1。与假手术组比较，TBI模型组大鼠错误次数（进入暗箱次数）增加（P＜0.05）；与TBI模型组比较，麝香酮组能减少错误次数（进入暗箱次数）（P＜0.05）。

表1 各组大鼠避暗实验检测结果比较（次，±s）

表1 各组大鼠避暗实验检测结果比较（次，±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与TBI创伤组比较，△P＜0.05。下同。

12 h 24 h 3.00±0.00 4.00±0.00 TBI创伤组 15.40±2.00* 9.80±2.00*组 别 3 d 7 d假手术组 3.00±0.00 3.00±0.00 n 10 10 12.10±2.50*14.80±1.00*麝香酮组 10 7.40±1.50△ 10.40±2.00△ 11.30±1.00△ 5.70±1.40△

图1 各组不同时间点脑组织病理切片图（HE染色，400倍）

2.2 HE染色观察脑损伤变化 见图1。假手术组：细胞间质致密，细胞排列有序，各个细胞结构正常，未见脑细胞肿胀及间质水肿，椎体细胞、神经元细胞、星型胶质细胞等未见细胞变性萎缩，毛细血管无扩张，未见炎症反应，静脉及动脉结构完整，未见血栓形成。TBI创伤组：正常细胞间质疏松、细胞排列杂乱，神经元细胞减少、残存神经元细胞肿胀，尼氏体溶解坏死（呈紫色），星型胶质细胞肿胀，有嗜神经现象（即小胶质细胞吞噬坏死神经元）、格子细胞（为吞噬了脂质的小胶质细胞）、脑实质内有散在的凝固性坏死和部分胶质细胞增生。脑实质内血管周围亦可见炎性细胞袖套状浸润。基底节纤维肿胀、崩解，静脉受压较动脉更明显，静脉中可见血栓形成。麝香酮组：可见神经元减少，有不同程度的恢复，排列趋于整齐，神经基质轻度肿胀，胶质增生不明显，受压的动脉及静脉恢复，静脉未见血栓形成。结果提示给大鼠静注麝香酮后，能够减轻大鼠创伤模型脑组织的病理学改变。

2.3 Westernblot检测MMP9蛋白的表达 见图2。TBI创伤组12 h MMP9蛋白表达开始细胞开始上升，在3 d达到顶峰，7 d后开始下降，与对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。麝香酮组MMP9蛋白表达与TBI创伤组比较在各个时间点明显降低（P＜0.05）。

图2 两组不同时间点MMP9蛋白表达电泳条带

3 讨 论

TBI为神经系统疾病，发病率高，常常导致患者死亡或致残，给社会及家庭带来沉重的负担［5］。TBI后会导致细胞功能发生改变，出现局部脑组织缺血缺氧、细胞水肿、颅内压增高，因此尽早改善损伤脑组织的缺血缺氧、细胞水肿、减少细胞凋亡，对患者预后及恢复功能有着重要的临床意义。

麝香具有醒脑开窍、通经活络的作用，目前研究证实麝香的主要活性成分为麝香酮，国内研究表明低剂量麝香酮（0.9 mg/kg）对于大鼠缺血性再灌注损伤具有保护作用［6］。本试验选择低剂量麝香酮观察对大鼠TBI早期MMP9蛋白的表达情况，探讨麝香酮神经保护的可能机制。

大鼠创伤后12 h开始出现神经功能的下降，HE染色发现细胞开始肿胀、细胞基质之间排列松弛、细胞排列紊乱，并且避暗实验也提示大鼠神经功能下降。3 d时大鼠神经功能明显下降，脑实质内有散在的凝固性坏死和部分胶质细胞增生。脑实质内血管周围亦可见炎性细胞袖套状浸润，大鼠神经功能下降最低；7 d时候细胞水肿减轻，大鼠神经功能部分恢复。麝香酮组在各个时间点较TBI创伤组大鼠神经功能恢复加快、细胞形态结构恢复有不同程度的提升，提示麝香酮有明显的神经保护作用。

脑组织中血脑屏障主要由毛细血管内皮细胞、血管基底膜以及胶质细胞终足构成，血管基底膜与间质内的细胞外基质是维持血脑屏障完整结构的重要结构基础。MMP9能降解和变性胶原类型Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ，破坏细胞外基质成分包括胶原蛋白Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ、弹性蛋白和明胶。MMP9破坏了血脑屏障的完整性，通透性增加，导致血管源性脑水肿［7］。抑制MMP9蛋白表达活性，可以抑制NF-κb信号通路，抑制炎症因子，自由基的表达，减少血脑屏障的破坏，减少细胞液的外渗，减轻血管源性脑水肿［8］。本实验发现，MMP9蛋白表达在12 h开始表达，在3 d达到高峰，HE染色同样提示，在3 d时候细胞及基质排列紊乱达到高峰，大鼠神经功能达到最低。因此抑制MMP9蛋白表达可能是治疗颅脑外伤后一个分子靶点［9］。John H.Zhang认为传统中药中活血化瘀、醒脑开窍等药物可能作用于大脑血管神经单位，对脑保护有重要的临床意义［10-11］。国内相关文献报道麝香酮对缺血性脑梗死及心肌梗死具有保护作用［12-13］。麝香酮可以减少抑制MMPs的表达，减轻中风后血脑屏障的破坏，麝香酮还能增强ATP酶活性，减少细胞的凋亡［14-15］。

综上所述，我们推测麝香酮在TBI中发现的脑功能保护作用可能是通过减轻细胞的水肿，从而改善了细胞的内环境，促进功能的改善。本实验发现麝香酮组在各个时间点MMP9蛋白表达较创伤组低，且大鼠神经功能改善明显，提示麝香酮可能是通过抑制MMP9蛋白表达从而改善了大鼠血脑屏障的破坏，减轻了脑水肿，促进细胞的存活从而达到神经保护的作用，但麝香酮对脑减轻脑水肿的机制有待我们进一步研究。

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