白念珠菌White-Gray-Opaque表型转换系统的研究进展

王钰婷 刘锦燕 赵悦 孟玲宁 项明洁

(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科，上海 200020)

白念珠菌是一种条件致病菌，常寄居于健康人体皮肤、口腔、胃肠道、阴道等部位。在人体免疫力低下时，可转换成致病菌引起表浅感染甚至是危及生命的系统性感染。据报道，大约75%的女性一生中至少被确诊患过1次阴道念珠菌病，而侵袭性念珠菌病则是引起新生儿重症监护室内 (NICU)晚期败血症的重要原因之一，其致死率可高达约30%[1]。白念珠菌的毒力作用是其致病的主要原因，其中表型转换是一大毒力因子，该菌可通过表型转换以更好地适应宿主体内的环境变化，进而促进其定植和感染。

在白念珠菌表型转换系统中，酵母-菌丝相转换和White-Gray-Opaque三态转换是最具代表性的，而White-Gray-Opaque转换作为一种新型表型系统吸引了越来越多研究者的关注。早在1987年时，就有学者在白念珠菌中发现White-Opaque转换；直到2014年，Tao等[2]发现了一种新的细胞形态，被称为gray表型，由此形成了White-Gray-Opaque三稳态转换系统。

1 White、Gray、Opaque表型特点

White、Gray、Opaque这三种细胞表型在细胞形态、菌落外观、交配能力、毒力、基因表达谱等方面均有区别[2-4]。通过肉眼观察不含荧光桃红B (Phloxine B)平板上的白念珠菌菌落，White细胞形成光滑的半球形白色菌落；Gray细胞为灰色、光滑的菌落；Opaque细胞为灰色、不透明的菌落，这三种细胞表型也由此命名。在电镜下，White细胞小而圆，呈椭球形，大小约4.9～6.8 m；Gray细胞小而长，呈梭形，比White细胞略大，大小约5.9～6.9 m；Opaque细胞大而长，形似扁豆，大小约9.5～11.8 m。在交配能力方面，White

此外，Gray细胞的全基因表达谱与White细胞和Opaque细胞有较大差异，Efg1、Wor1分别在White、Opaque细胞中特异性高表达，是诱导和维持相应表型的核心调节因子。Lip9、Pga26、Hsp31、Hms1等基因是Gray表型的特异性表达基因，但是维持Gray表型的主要调节因子目前还不明。

2 White-Gray-Opaque形态转换的调控

白念珠菌White-Gray-Opaque转换不同于经典的酵母-菌丝相的表型转换。菌丝形成需要环境因素的刺激，如37℃生理温度、CO2、中性至碱性条件、血清、N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc)等，而White-Gray-Opaque转换既可在环境刺激下发生，又可自发发生，三类细胞的表型是稳定且可遗传的[5-6]。

2.1 环境因素影响White-Gray-Opaque形态转换

White-Gray-Opaque三稳态转换系统受许多外界环境因素的影响，比如CO2、GlcNAc、温度和环境pH。研究发现，CO2和GlcNAc促进White向Opaque细胞进行转换，有利于白念珠菌维持Opaque形态，但对于White细胞向Gray细胞的转换没有明显影响[7-8]。同时，在GlcNAc作为碳源的培养条件下，较高的温度 (>27℃)可促进细胞从White向Opaque表型转换，低温不利于维持Opaque表型[9]。目前有研究发现，酸性pH (pH4～6)可促进基因型为MTLα/α的菌株向Opaque表型转化，而在MTLa/a的菌株中则未观察到这种现象[10]。pH作为环境因子可影响部分菌株的White-Opaque表型转化，但目前未见pH对Opaque-White转换及Gray表型诱导的报道。

2.2 交配基因座 (Mating type locus，MTL)

最初发现White-Opaque表型转换系统时，研究者认为交配基因座 (Mating type locus，MTL)可调控White-Opaque转换，只有纯合型菌株才可进行White-Opaque转换[11]，这是因为MTLa/α杂合型菌株形成MTLa1/α2复合体抑制Wor1表达，降低了白念珠菌向Opaque表型转换的频率[12]。然而，随着研究的深入，Xie等[13]在GlcNAc作为碳源和5%CO2的条件下，发现MTL杂合型菌株也可被诱导生成Opaque表型。这一研究提示，在一定的培养条件下，白念珠菌均可以发生White-Opaque转换。在此基础上，Tao等的研究显示，在MTL缺陷株 (MTLa/Δ和MTLΔ/α)中，白念珠菌仍能表达White、Gray和Opaque这三种表型，且MTL缺陷株Gray细胞与其亲代MTLa/α株Gray细胞在形态上几乎是一致的[2]。由此可见，MTL纯合子在某些培养条件下可以影响表型转换的频率，但它并不是维持White、Gray和Opaque表型的必要因子。

2.3 分子调控机制

在分子调控层面，目前已知在White-Gray-Opaque表型转换中起重要作用的是Wor1和Efg1[12]。Wor1是维持Opaque表型的关键转录因子；wor1Δ/Δ缺陷株细胞转换为Opaque表型会受到阻滞。Efg1是维持White表型的必要因子；efg1Δ/Δ缺陷株不能完成向White表型的转换。WOR1和EFG1双缺失的菌株细胞保持在Gray表型，任何培养条件下均不能实现向White或Opaque表型的转换[2]。由此可见，Wor1、Efg1分别对于White、Opaque表型的形成是必需的，但目前对于Gray表型形成的重要分子仍未明确。除此之外，Wor2、Wor3和Czf1在Opaque细胞中的表达高于White细胞，利于维持Opaque表型[14]。Wang等发现，Ahr1作为是一类锌指蛋白，必须在Efg1存在的条件下才能促进细胞向White表型转换[15]。

2.4 组蛋白乙酰化修饰

蛋白质乙酰化修饰的功能主要是对细胞染色体结构的影响以及调控核内转录调控因子的激活。一般认为，组蛋白乙酰转移酶 (Histone Acetyltransferase, HAT)参与组蛋白的乙酰化, 促进基因活化; 组蛋白去乙酰化酶 (Histone Deacetylase，HDAC)参与组蛋白的去乙酰化，主要使基因沉默[16]。目前的研究成果显示，在白念珠菌中，组蛋白乙酰化修饰在调节Opaque表型也起着重要作用。

Stevenson等[17]发现，在白念珠菌中，RTT109 (组蛋白H3K56乙酰转移酶编码基因)和HST3 (组蛋白H3K56去乙酰酶编码基因)在White-Opaque转换中起着拮抗作用。RTT109位于WOR1上游，通过促进组蛋白H3K56的乙酰化，从而上调Opaque表型。而HST3的作用与RTT109相反，HST3促进H3K56的去乙酰化，下调Opaque表型。

此外，Xie等[18]研究发现，Rpd3和Rpd31是位于WOR1上游的分子，Rpd31仅比Rpd3有一个延长的C末端，但两者对WOR1的转录起着截然不同的作用。Rpd3通过与其他共调节因子形成CaRpd3L复合物降低HDAC活性，乙酰化水平升高，进而促进WOR1基因转录，上调Opaque表型的表达。而Rpd31作用相反，通过形成CaRpd31S复合物抑制WOR1基因转录，下调Opaque表型的表达。

3 White、Gray、Opaque表型与宿主的相互作用

3.1 White、Gray、Opaque表型对宿主的作用

研究显示，White、Gray、Opaque表型在宿主感染不同部位起着不同作用。Tao等[19]通过尾静脉注射感染小鼠，发现肾脏载菌量White>Opaque>Gray细胞，与小鼠生存曲线显示的White细胞感染小鼠最早死亡的结果相一致。而在皮肤表浅感染中，用不同表型的白念珠菌感染小鼠舌头，细胞繁殖速度Gray>Opaque>White细胞，且Gray细胞所造成的皮肤损伤也较另两种表型严重[2]。临床研究也显示，在念珠菌性外阴阴道病患者中分离出的白念珠菌三种表型的毒力为Gray>Opaque>White。

此外，白念珠菌各表型细胞代谢相关的基因谱不同，各表型在代谢途径和营养物质的利用上存在差异，在人体内存在代谢适应[5]。通过基因谱分析显示，White细胞主要是发酵代谢，Opaque细胞是氧化代谢[20]，而Gray细胞代谢相关的表达谱则与前两者有着较大差异[2]。同时，在White细胞中，糖代谢有关的基因表达较高，如葡萄糖转运蛋白编码基因 (HXT3、HXT4、HXT7)、糖酵解酶编码基因 (HXK1)、磷酸果糖激酶编码基因 (PFK2)等。在Opaque细胞中，则高表达参与三羧酸循环酶的编码基因，如异柠檬酸脱氢酶编码基因 (IDP2)和苹果酸脱氢酶编码基因 (MDH1)，而三羧酸循环是三大营养素 (糖类、脂类、氨基酸)的最终代谢通路，提示Opaque细胞可利用多种营养物质[20-21]。在人体血液中含有葡萄糖，而皮肤中则没有，这可以解释为什么糖代谢有关基因高表达的White细胞在系统性血流感染中往往具有更高的毒力。

3.2 宿主对White、Gray、Opaque细胞的作用

在发生感染时，免疫细胞对不同表型的细胞作用不同。Geiger等[22]发现，White细胞产生中性粒细胞趋化因子，而Opaque细胞不产生这种趋化因子，从而减少中性粒细胞移行到感染部位，这可能是Opaque细胞逃避粒细胞吞噬的一种机制。在Mallick的研究中，将White细胞和Opauqe细胞分别与以下具有吞噬功能的免疫细胞反应：果蝇S2细胞、小鼠RAW264.7巨噬细胞、小鼠骨髓来源的巨噬细胞 (BMDM)和人中性粒细胞，结果发现这些吞噬细胞对White细胞吞噬率为均高于Opaque细胞[23]。中性粒细胞和巨噬细胞选择性地吞噬Opaque细胞，而研究发现树突细胞可同时吞噬White和Opaque细胞[24]。目前，关于免疫细胞如何作用于Gray细胞的研究还未见报道。

4 结语与展望

表型转换作为白念珠菌的一种新型毒力因子，表型改变后，其致病力、毒力与宿主免疫作用等均会发生改变，各个表型在宿主适应、感染及不同生活阶段发挥着不同作用[5]。目前White-Gray-Opaque表型转换的影响因素有着较为深入的研究，尤其是调控机制方面。像乙酰化转录后修饰机制也越来越引起研究者的关注，那么其他转录后修饰作用如磷酸化、泛素化、甲基化等是否也对该表型系统有作用？同时白念珠菌作为与人体共生的真菌，各表型除了与宿主免疫细胞的相互作用，与人体还有什么其他的关系？White-Gray-Opaque表型系统仍有许多问题值得研究，白念珠菌形态对环境的适应性也比原先认为的要复杂得多，因此，表型的研究有助于解释病原体是如何适应各种环境的，深入了解形态调节机制有助于寻找感染治疗的新策略。