补骨脂酚对UVB诱导HaCaT细胞凋亡因子p53和caspase—3表达的影响

孙琪+朴成玉+陈丹丹等

[摘要]目的：探讨补骨脂酚对UVB诱导HaCaT细胞凋亡因子p 53和caspase-3表达的影响及其机制。方法：四甲基噻唑蓝[3-（4，5-Dimethyl-2-Thiazolyl）-2，5-Diphenyl Tetrazolium Bromide，MTT]法检测不同浓度补骨脂酚对正常细胞增殖的影响。实验设计分为四组，空白组、模型组、雌二醇组及补骨脂酚组。以照射强度0.61mW/cm²，照射时间10min，建立HaCaT细胞凋亡模型；MTT法检测各组细胞增值率；活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）试剂盒检测各组细胞中ROS含量变化；线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）检测各组细胞线粒体膜电位变化；实时定量PCR（Reverse transcriptional PCR，RT-PCR）检测各组细胞中caspase-3 mRNA表达水平；蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测各组细胞中p53、caspase-3蛋白表达水平。结果：10^-6mol/L补骨脂酚组细胞增值率无明显变化（P>0.05），但是可降低ROS含量、线粒体膜电位、caspase-3mRNA表达量、p53及caspase-3蛋白表达量（P<0.05）。结论：补骨脂酚可抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡，其作用机制主要是通過降低细胞内活性氧的含量、降低细胞线粒体膜电位、抑制p53及caspase-3的表达。

[关键词]补骨脂酚；UVB；HaCaT；凋亡；p53；caspase-3

[中图分类号]R285.5 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）07-0037-04

紫外线包括UVA（长波）、UVB（中波）及UVC（短波）三种不同波长。其中UVB虽然波长短，但是辐射强度大，可以穿透表皮，因此UVB越来越引起人们的关注。紫外线照射剂量超过皮肤承受能力，会引发皮肤炎症、老化、凋亡甚至皮肤癌。豆科植物补骨脂干燥成熟种子中除了含有补骨脂素及异补骨脂素，还含有少量的补骨脂酚。补骨脂酚是补骨脂挥发油的主要成分，约占60%。研究表明，补骨脂酚具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗抑郁以及雌激素样作用。近几年来，补骨脂酚的研究越来越多，有报道称，补骨脂酚对成纤维光老化衰老基因具有调控作用，与本实验研究结果相近。本研究选择UVB诱导HaCaT细胞凋亡模型作为研究对象，观察补骨脂酚对UVB诱导HaCaT细胞凋亡因子p53、caspase-3 mRNh及蛋白表达的影响。

1材料和方法

1.1实验材料：细胞株为人永生化角质形成细胞，来源于上海中乔新舟有限公司。

主要仪器：SS-01B型UVB紫外光疗仪（上海希格玛高技术公司）；MK3型酶标仪（上海热电仪器有限公司）；SmartChemi500型一体式微型化学发光成像仪（北京赛智创业有限公司）。

试剂：补骨脂酚标准品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-15012210）；雌二醇标准品（中国药品生物制品检定所）；DMEM培养液（Hyclone公司，批号：NZM1301）；胎牛血清（FBS）（Hyclone公司，批号：NYB0614）；四甲基噻唑蓝（MTT）（Sigma公司，批号：021005）；线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）（碧云天生物技术）；小鼠抗人β-actin单克隆抗体（北京中杉金桥有限责任公司）；兔抗人p53多克隆抗体（南京恩晶生物科技有限公司）；兔抗人caspase-3多克隆抗体（博奥森生物有限公司）；羊抗小鼠二抗（博士德生物有限公司）；羊抗兔二抗（博士德生物有限公司）。

1.2实验方法

1.2.1溶液配制：雌二醇溶液配制：将0.23mg雌二醇粉末放入到2ml无水乙醇中进行混合，加入吐温250μl，再使用DMEM培养液进行10倍稀释，最终浓度达到1×10^-7mol/L，最后0.22Pm微孔滤膜过滤除菌，-20℃冰箱保存待用。

补骨脂酚溶液配置：精密称取补骨脂酚2.54mg，用10μl二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide，DMS0）将其充分溶解，再加I）MEM基础培养基定容至10ml，浓度为10^-3mol/L，0.22μm滤膜滤过除去细菌及杂质，DMEM培养液稀释补骨脂酚，稀释浓度分别为10 4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L、10^-7mol/L、10^-8mol/L、10^-9mol/L、10^-10mol/L、10^-11lmol/L等9个浓度，-20℃冰箱保存待用。

JC-1染色工作液配置：将8ml纯水加入到50μl JC-1（200×）中进行混匀，再加入2ml JC-1染色缓冲液（5×）混匀即可。

JC-1染色缓冲液（1×）配置：取3ml JC-1染色工作液（5×）加入12ml纯水，混匀，放于冰浴中保存待用。

1.2.2 HaCaT细胞凋亡模型的建立及分组：参照文献，按每孔15×10³个细胞接种于96孔板，将其分为空白组、模型组、10^-7mol/L雌二醇及10^-6mol/L补骨脂酚组。培养24h后，空白组及模型组分别加入新的培养液继续培养；10^-7mol/L雌二醇及10^-6mol/L补骨脂酚组分别加入相应的药物溶液培养。24h后，空白组更换新的培养液，使用铝箔纸盖上继续培养24h；模型组、10^-7mol/L雌二醇及10^-6mol/L补骨脂酚组弃去培养液，分别加入200μl磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Solution，PBS）覆盖，选择最佳照射时间10min进行照射，弃去PBS后继续加入新的培养液继续培养24h。最终，加入20μl MTT及150μl DMSO，酶标仪检测各组细胞吸光值。endprint

1.2.3细胞增长率测定：参照文献，取对数生长期细胞，接种于96孔板，培养24h，根据预实验结果，选定10^-11、10^-10、10^-9、10^-8、10、1^-7、10^-6、10^-4及10^-3mol/L九个浓度补骨脂酚加入96孔板中，继续培养24h，弃去旧培养液，继续加入新培养液培养24h，再加入20μl MTT及150μl DMSO，于492nm波长处酶标仪检测每组间细胞的吸光值。细胞增殖率=给药组OC值/空白组OD值（其值设为1）×100%。

1.2.4 ROS试剂盒检测ROS含量：取对数生长期的细胞，消化、离心，接种于6孔板后，进行分组，分别为空白组、模型组、10^-7mol/L雌二醇及10^-6mol/L补骨脂酚组，于37℃5%CO₂培养箱中培养，72h后取出，弃掉培养液，加入1mlDCFH-DA（10μM/L）溶液，放于培养箱孵育20min，每隔5min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。采用无血清的培养液洗涤3次，PBS清洗3次，加入胰蛋白酶进行消化，培养液终止消化，离心，放于1.5ml离心管中，加入1mlPBS重悬细胞，滤网滤过。最后，使用流式细胞仪检测各组细胞中ROS含量。

1.2.5线粒体膜电位试剂盒检测各组细胞膜电位变化：建模成功后，收集每组细胞分别放于1.5ml离心管中，参照文献，每管中分别加入0.5ml培养液及0.5ml JC-1染色工作液混匀，37℃培养箱中孵育20min，加入1ml JC-1染色缓冲液（1×）重悬，6009 4℃离心5min，弃上清，重復2次，再加入1ml JC-1染色缓冲液（1×）重悬，流式细胞仪进行检测。

1.2.6 RT-PCR测定各组细胞中mRNA表达水平：建模成功后，Trizol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇提取各组RNA，使用Nano-100微量分光光度计测定RNA纯度和浓度，计算所需体积数，按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为eDNA，然后以cDNA为模板进行实时定量PCR。caspase-3引物（F：5-TGGTTCATCCAGTCECl3TG-3，R：5-ATTCTGTTGCCAC-TITTCG-5）。

反应程序：预变性95℃ 5min，变性95℃ 30s，退火/延伸60℃ 60s，30个循环。本实验的循环数即Ct值、融解曲线和扩增曲线可从real-time PCR上直接读取。β-actin作为各处理组的内参基因，caspase-3等目的基因在处理组相对于对照组的AACt值计算得出：AACt=（Ct目的基因Ct内参基因）处理组-（Ct目的基因-Ct内参基因）对照组，按照公式可算出各组caspase-3等目的基因相对于对照组表达量：目的基因相对表达量=2-ΔΔCt。

1.2.7 Western Blot检测各组细胞中蛋白表达水平：建模成功后，按300μl/瓶加入RIPA裂解液，使用前2～3min需向裂解液内加入3μl PMSF（终浓度1mM），选用BCA试剂盒测蛋白浓度，电泳75min，转膜35min，封闭液封闭2h，一抗（1：300）孵育，于4℃条件下过夜。次日，二抗（1：10 000）孵育1h，加入TBST后放于床上震荡，重复3次，在膜上滴加发光工作液，把膜置于化学发光成像仪内，曝光并拍照，分析图像结果，应用Lane ID凝胶分析系统分析条带灰度（IOD），分析并获得各条带的灰度值，目的蛋白的表达水平根据靶条带的灰度值与内参（β-actin）的灰度值的比值来反映。

1.3统计学分析：采用SPSS23.0软件进行分析，计量资料均用（x±s）表示，将用单因素方差分析（one-wayANOVA）进行分析，经组间比较方法，两两比较采用LSD法。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2结果

2.1不同浓度补骨脂酚对细胞增殖率的影响：如表1所示，与空白组相比，10^-11、10^-10、10^-9、10^-8、10^-7mol/L补骨脂酚组细胞增殖率明显上升（P<0.01），10^-5、10^-4、10^-3mol/L补骨脂酚组细胞增殖率明显降低（P<0.05），10^-6mol/L补骨脂酚组细胞增值率无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2补骨脂酚作用于光老化模型对细胞活性的影响：如表2所示，与空白组相比，模型组细胞增殖率明显下降（P<0.01）；与模型组相比，10^-7mol/L雌二醇组及10^-6mol/L补骨脂酚组细胞增殖率明显上升，差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.3 ROS含量测定结果：如表3所示，与空白组相比，模型组ROS含量明显升高（P<0.01）；与模型组相比，10^-7mol/L雌二醇组及10^-6mol/L补骨脂酚组ROS含量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4线粒体膜电位测量结果：如表4所示，与空白组相比，模型组线粒体膜电位明显增加（P<0.01）；与模型组相比，10^-7mol/L雌二醇组及10^-6mol/L补骨脂酚组线粒体膜电位明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.5各组细胞中caspase-3 mRNA表达量测定结果：如表5所示，与空白组相比，模型组中easpase-3 mRNA表达量升高（P<0.01）；与模型组相比，10^-7mol/L雌二醇组及10^-6mol/L补骨脂酚组caspase-3 mRNA表达量均降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。

2.6各组细胞中p53、easpase-3蛋白表达量测定结果：如表6及图1所示，与空白组相比，模型组中P53及caspase-3蛋白表达量明显上升（P<0.01）；与模型组相比，10^-7mol/L雌二醇组及10^-6mol/L补骨脂酚组中p53及easpase-3蛋白表达量明显下降，差异具有统计学意义（P<0.01）。

3讨论

皮肤易遭受紫外线辐射诱发细胞凋亡。因角质形成细胞位于皮肤表皮层，紫外线主要诱导角质形成细胞凋亡。其中p53可以被UVB诱导的DNA损伤所激活，细胞凋亡主要是由多个信号通路调控的死亡过程，p53蛋白在细胞的凋亡过程中占有重要的作用。p53蛋白和半胱氨酸盐酸天冬氨酸蛋白-3（caspase-3）是促凋亡基因，在DNA损伤、细胞凋亡、癌基因的激活等方面发挥重要作用。caspase-3蛋白酶作为细胞凋亡的终极指标，是参与细胞凋亡的关键酶，其中，caspase-3可以促使各种凋亡因子被激活，一旦被激活，可以使细胞内蛋白质降解，最终导致细胞死亡。p53参与调控线粒体凋亡通路，主要是通过对线粒体膜上Bcl-2家族蛋白成员的转录调控，使线粒体膜电位发生改变，最终导致激活caspases-3以及启动细胞凋亡级联反应。

为了阐明补骨脂酚对HacaT细胞凋亡保护作用的机制，本研究继续观察补骨脂酚对凋亡相关基因（p53、caspase-3）表达的影响，结果显示，与空白对照组相比，模型组凋亡相关基因p53、caspase-3表达水平显著升高，该结果与模型组HaCaT细胞凋亡水平显著升高相一致。而给予10^-7mol/L雌二醇及10^-6mol/L补骨脂酚治疗后，与模型组相比，治疗组HaCaT细胞凋亡水平显著降低。

综上所述，本研究结果证实补骨脂酚对HaCaT细胞凋亡保护作用的机制可能是通过调节p53及caspase-3相关基因的表达。通过本实验研究发现，可以将补骨脂酚应用于天然化妆品中，为预防紫外线对皮肤的破坏奠定一定的理论基础。endprint