腺苷受体A1亚型对视网膜色素上皮细胞免疫调节功能的影响

孔繁强，周树民，张伟，陈松

腺苷（adenosine）为三磷酸腺苷（ATP）的代谢产物，部分研究认为其对机体有免疫调节作用［1-2］。细胞损伤或缺氧时会大量释放ATP到细胞外，促进局部炎症反应的进展［3］；位于细胞膜上的2种磷酸酶CD39和CD73可迅速转化ATP为腺苷［4-5］。腺苷与其受体（adenosine receptors，ARs）相结合，可发挥局部免疫调节作用［6-7］。笔者此前研究显示，视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞是眼底组织中唯一高表达CD73的细胞，提示RPE在产生和利用腺苷上具有重要的作用［8］。ARs系统由ARA1、ARA2A、ARA2B及ARA3这4种亚型组成，它们在不同组织、细胞中的表达、分布及对腺苷的亲和力显著不同［9-10］。而这些不同亚型的ARs在功能上也截然不同。因此，了解不同种类的细胞是通过何种AR来利用腺苷是研究腺苷局部免疫调节作用的前提。本文旨在探讨ARPE-19细胞中高亲和力的腺苷受体亚型及其潜在功能。

1 资料与方法

1.1 一般资料 人ARPE-19细胞购自中国医学科学院细胞库；RNA提取试剂Trizol、人单核细胞趋化因子1（MCP-1）及C-X-C配体 10（CXCL10/IP-10）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immune sorbent assay，ELISA）试剂盒购自Invitrogen公司；白细胞介素（IL）-6、IL-10、转化生长因子 β（TGF-β）的ELISA试剂盒购自R&D公司；逆转录试剂及定量PCR试剂盒购自大连宝生物公司；小鼠抗人ARA1、ARA2A、ARA2B、ARA3单克隆抗体购自Santa Cruz公司；HRP标记的兔抗小鼠IgG购自武汉博士德公司；放射性H3标记的腺苷（H3-adenosine）购自北京原子能研究所；ARA1拮抗剂DPCPX、ARA2A拮抗剂SCH58261、ARA2B拮抗剂MRS1754、ARA3拮抗剂MRS1220及ARA1激动剂CCPA购自美国Tocris公司。

1.2 腺苷受体在RPE中的表达 体外培养ARPE-19细胞于6孔细胞培养板中，至80%融合后取3孔细胞充分洗涤，加入Trizol试剂（1 mL/孔），室温静置5 min后刮除细胞，置于Trizol试剂中，参照试剂说明书进行RNA提取。取1.0µg总RNA逆转录合成cDNA；取少量cDNA，real-time PCR测定4种腺苷受体基因的表达以gapdh为内参照。上、下游引物序列见表1。另3孔细胞参照文献［11］用于膜蛋白提取及Western blot检测：取适量膜蛋白（1µg/样本）行SDS-PAGE分离，半干法转移凝胶中的蛋白条带至硝酸纤维素膜（NC膜）上。剪取单个样本的NC膜，经5%脱脂奶粉溶液封闭后，分别用抗ARA1、ARA2A、ARA2B及ARA3的抗体孵育，4℃过夜。充分洗涤后置于含HRP-兔抗小鼠IgG抗体的溶液中，室温放置1 h。充分洗涤后将NC膜置于ECL发光底物中，室温放置10 min，于暗盒中对X-ray胶片曝光、显影及定影。

Tab.1 Primers used for real-time PCR表1 定量PCR引物序列

1.3 放射性配体结合实验 体外培养ARPE-19细胞至80%融合，按1×105个/mL密度接种至96孔细胞培养板。待细胞充分贴壁后加入不同剂量（0、5、10、30、100、200、400、800及 1 200 nmol/孔）H3-adenosine，每个剂量设立 3个复孔。37℃温育1 h，抽吸转移细胞至GF/C膜。先后以去离子水及95%乙醇充分洗涤、晾干后加入闪烁计数液，以液体闪烁计数器计数放射强度后计算出细胞所结合的腺苷量，绘制H3-adenosine结合曲线；Scat chart作图计算出RPE对腺苷的最大结合容量（Bmax），以单位数量细胞（1×104细胞）理论上所能结合的最多腺苷量（单位：fmol）来表示。

1.4 不同亚型腺苷受体对RPE结合腺苷的贡献 将ARPE-19细胞接种至96孔细胞培养板，平均分为5组（A～E），每组含27孔细胞，分别给予1.3中所示的9种H3-adenosine浓度，每个浓度设3个复孔。其中，A组为对照组；B～E组所有细胞分别给予ARA1拮抗剂DPCPX（终浓度50 nmol/L）、ARA2A 拮抗剂 SCH58261（100 nmol/L）、ARA2B 拮抗剂 MRS1754（100 nmol/L）及 ARA3 拮抗剂 MRS1220（5µmol/L），37℃温育30 min。此后，按照1.3中所述方式计算每组细胞结合腺苷的Bmax（n=3）。

1.5 ARA1信号通路对ARPE-19分泌细胞因子及趋化因子的影响 体外培养ARPE-19细胞至80%融合，随机分为对照RPE组（不予ARA1激动剂）及CCPA干预RPE组（CCPA 100 nmol/L），每组6孔细胞。2组细胞均给予TNF-α 10µg/L及IFN-γ 1 000 U/mL联合干预。48 h后收集上清，ELISA法检测 IL-6、IL-10、TGF-β、MCP-1、IP-10 含量。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行统计处理。符合正态分布的计量数据以均数±标准差（±s）表示。2 组比较采用t检验，多组比较采用方差分析，组间多重比较用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 APRE-19细胞中4种腺苷受体的表达 在体外培养的APRE-19细胞中既可以检测到4种腺苷受体基因mRNA的表达，也可通过Western blot定性探测到这4种腺苷受体分子在APRE-19细胞膜上的存在，见图1。

Fig.1 mRNA expression and membrane distribution of adenosine receptor subtypes in ARPE-19图1 4种腺苷受体的mRNA表达及其在ARPE-19细胞膜上表达情况

2.2 RPE腺苷结合曲线及最大腺苷结合容量 RPE结合腺苷的饱和曲线显示，随着H3-adenosine加入剂量的增加，RPE对腺苷的结合逐渐达到饱和；Scat chard作图结果示RPE对腺苷的Bmax=2.04 fmol，见图2。

Fig.2 Results of adenosine binding assay图2 RPE腺苷结合实验结果

2.3 不同腺苷受体亚型对ARPE-19细胞结合腺苷的影响A～E组的Bmax（单位：fmol）分别为2.04±0.31、0.44±0.06、1.82±0.28、2.01±0.42 及 2.06±0.44（F=13.195，P＜0.01）。其中B组较其他各组Bmax均降低（P＜0.01），其他各组间比较差异均无统计学意义。

2.4 细胞因子及趋化因子的ELISA结果比较 与对照RPE组比较，CCPA干预RPE组IL-6、MCP-1及IP-10的含量降低、IL-10的含量增加（P＜0.01）。2组TGF-β的含量差异无统计学意义，见表2。

Tab.2 Effects of ARA1 signaling on RPE’s production of cytokines and chemokines表2 ARA1信号通路对RPE分泌细胞因子、趋化因子的影响（n=6，ng/L，±s）

Tab.2 Effects of ARA1 signaling on RPE’s production of cytokines and chemokines表2 ARA1信号通路对RPE分泌细胞因子、趋化因子的影响（n=6，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01

3 讨论

腺苷及其受体构成了非常复杂的免疫调节系统，在肿瘤免疫及炎症免疫中均具有巨大的潜在应用价值［12］。该系统的复杂性表现在多个方面，如受体多样性、分布广泛性［13-14］及表达高度可变性［15］。正是基于腺苷-腺苷受体系统的复杂性，本文对其进行研究时只能由单一细胞或单一组织入手再逐渐展开。本研究中real-time PCR及Western blot结果证实，4种腺苷受体亚型在ARPE-19细胞中均有表达。但是，受体的表达往往会受到负反馈调节机制的调节，即某一强烈的受体信号可以反馈性抑制该受体的表达，导致受体的表达水平及其功能可能不是正相关，甚至是负相关的［16］。与受体的表达水平不同，受体对配体的结合情况与其功能多是正相关的［17］，因此，在研究受体表达的同时也要研究其配体结合情况。不同腺苷受体亚型对RPE结合腺苷的影响结果显示，ARA1拮抗剂干预组较其他各组Bmax均降低，而其他各组间差异均无统计学意义，表明ARA1是ARPE-19细胞中结合腺苷能力最强的受体亚型。研究显示，以TNF-α及IFN-γ联合干预的方式可充分激活ARPE-19细胞，使其大量分泌细胞因子及趋化因子［18］。本研究显示，在TNF-α及IFN-γ联合干预的ARPE-19细胞培养基中检测到细胞因子IL-6、IL-10、TGF-β及趋化因子MCP-1、IP-10的存在，给予ARA1的激动剂可显著性抑制ARPE-19细胞产生 MCP-1、IP-10、IL-6这些促炎因子，而促进抑炎因子IL-10的产生，提示ARA1通路与RPE细胞的免疫抑制功能密切相关。

综上所述，4种腺苷受体亚型在ARPE-19细胞中均有表达，放射性配体结合实验分析显示ARA1在ARPE-19细胞中具有相对较强的腺苷结合能力，该受体信号介导潜在的免疫抑制功能。

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