美托洛尔对腹主动脉缩窄大鼠心肌CalpainⅠ、CaN信号通路的影响

姚健 ，朱健华 ，盛红专 △

心肌肥厚作为心脏对多种刺激的适应性反应，早期可减轻室壁压，维持心功能；但长期的心肌肥厚可导致心肌缺血、心律失常、心衰甚至猝死，逆转心肌肥厚可改善预后。研究显示，β受体阻滞剂可预防或逆转心肌肥厚［1-2］。钙调神经磷酸酶（calcineurin，CaN）是迄今发现的唯一受钙/钙调素活化的蛋白磷酸酶，其通过介导底物——核转录因子3的去磷酸化实现核转移，从而在多种原因所致的心肌肥厚中发挥重要作用，抑制CaN信号通路可预防和逆转心肌肥厚［3］。钙蛋白酶Ⅰ（CalpainⅠ）是一种Ca2+依赖性的半胱氨酸蛋白激酶，活化的CalpainⅠ在体外可剪切上百种蛋白。Burkard等［4］利用培养心肌细胞的方法已证实，血管紧张素Ⅱ可诱导CalpainⅠ活化后CaN羧基端的蛋白水解活化，推测存在CalpainⅠ作为上游信号因子调控CaN活性的信号通路。本实验采用腹主动脉缩窄致压力超负荷的大鼠心肌肥厚模型，以β受体阻滞剂美托洛尔干预，观察大鼠心肌肥厚程度及心肌中CalpainⅠ和CaN的变化，探讨CalpainⅠ、CaN信号通路在美托洛尔预防压力超负荷所致心肌肥厚中的作用。

1 材料与方法

1.1 大鼠心肌肥厚模型的制备与分组 清洁级健康、雄性SD 大鼠 30只，7～8周龄，体质量（200±20）g，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司。参考文献［5］将大鼠麻醉后制备腹主动脉缩窄的压力超负荷模型。大鼠随机均分为假手术组（不缩窄腹主动脉，其余步骤同手术组）、手术组（单纯行腹主动脉缩窄术）、美托洛尔组（在腹主动脉缩窄基础上予美托洛尔每天灌胃），每组10只。美托洛尔组在手术当日始予美托洛尔（由阿斯利康公司提供）30 mg/（kg·d）灌胃，假手术组和手术组喂以等量生理盐水，共4周。其中手术组和美托洛尔组在术后1周内各死亡1只。

1.2 大鼠血压、心肌标本采集与质量测定 术后4周，各组大鼠称体质量（body weight，BW）后以2%戊巴比妥钠2 mL/kg腹腔注射麻醉后分离左侧颈总动脉，插入内充有肝素及生理盐水的导管，记录动脉血压［收缩压（SBP）/舒张压（DBP）］，随后处死大鼠，取出心脏，用冰生理盐水冲去余血，滤纸吸干水分，电子天平称取左心室质量（left ventricular weight，LVW），以左心室质量/体质量（LVW/BW，单位：mg/g）作为判断大鼠心肌肥厚程度的指标［5］。

1.3 逆转录PCR（RT-PCR）法检测CaN mRNA表达 取大鼠左室心肌组织50～100 mg，用TRIzol法提取总RNA，逆转录后进行PCR扩增。PCR反应条件、引物序列等参考本研究组前期研究［6］进行，并对PCR产物行直接测序证实准确性。

1.4 Western blot法检测CaN和CalpainⅠ蛋白质表达 取大鼠左室心肌组织100 mg，提取心肌胞浆蛋白，BCA法测定蛋白浓度，参照文献［6］以GAPDH为内参进行目的蛋白CaN和CalpainⅠ蛋白表达量测定，结果以目的蛋白CaN或CalpainⅠ与GAPDH蛋白条带的光密度比值表示。

1.5 CaN活性测定 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（Calcineurin Cellular Activity Assay Kit，Colorimetric Merck公司）检测。在酶标仪A620处读取吸光度（A）值，用试剂盒中的CaN标准品制备关于CaN活性与吸光度的标准曲线，根据各个样本测定的A值和标准曲线计算CaN酶活性［6］。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。符合正态分布的计量数据以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较用单因素方差分析，组间多重比较用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠心肌肥厚程度及血压的变化 腹主动脉缩窄术后4周，手术组大鼠SBP、DBP、LVW/BW均较假手术组增高（P＜0.05）；美托洛尔组大鼠SBP、DBP虽较手术组略下降，但差异无统计学意义（P＞0.05），且仍高于假手术组（P＜0.05）。与手术组相比，美托洛尔组大鼠LVW/BW下降（P＜0.05），与假手术组差异无统计学意义，见表1。

Tab.1 The changes of cardiac hypertrophy and blood pressure in three groups of rats表1 各组大鼠左心室心肌肥厚程度与血压变化（±s）

Tab.1 The changes of cardiac hypertrophy and blood pressure in three groups of rats表1 各组大鼠左心室心肌肥厚程度与血压变化（±s）

＊P＜0.05；a与假手术组比较，b与手术组比较，P＜0.05；表2同；1 mmHg=0.133 kPa

2.2 CaN mRNA、蛋白表达和活性变化 手术组心肌CaN mRNA、CaN蛋白及活性较假手术组均升高（P＜0.05）。美托洛尔组3个指标较手术组下降（P＜0.05），但与假手术组差异均无统计学意义，见表2、图 2。

Tab.2 The changes of protein expression and activity of CaN mRNA in three groups表2 各组大鼠心肌中CaN mRNA、蛋白表达和活性变化（±s）

Tab.2 The changes of protein expression and activity of CaN mRNA in three groups表2 各组大鼠心肌中CaN mRNA、蛋白表达和活性变化（±s）

2.3 CalpainⅠ蛋白表达的变化 假手术组、手术组及美托洛尔组心肌CalpainⅠ蛋白表达量分别为0.233±0.018、0.613±0.086 和 0.326±0.102（F=10.286，P＜0.05），其中手术组为假手术组 2.63倍（P＜0.05）；美托洛尔组较手术组下降（P＜0.05），见图2。

Fig.1 The changes of CaN protein expression in three groups of rat heart tissues图1 大鼠心肌CaN蛋白表达变化

Fig.2 The changes of protein expression of CalpainⅠin three groups of rat heart tissues图2 大鼠心肌CalpainⅠ蛋白表达的变化

3 讨论

心肌肥厚早期可维持心功能，但长期的心肌肥厚可导致心脏多种并发症发生，β受体阻滞剂可预防或逆转心肌肥厚。本研究结果显示，腹主动脉缩窄术后4周，手术组大鼠SBP、DBP及LVW/BW较假手术组显著升高，提示模型制备成功，大鼠发生了血压升高、心肌肥厚。CaN是一种受钙和钙调素活化的蛋白磷酸酶，当胞内钙离子浓度升高时，CaN与钙、钙调素结合，CaN自主抑制区发生变构、移位，对催化区的抑制消失，CaN活化；活化的CaN可导致底物——核转录因子3的去磷酸化并核转移，从而介导多种胚心基因表达、心肌肥厚。本实验中手术组在发生心肌肥厚同时，心肌中CaN活性高于假手术组，同时还存在CaN mRNA和蛋白表达水平较假手术组升高，提示CaN参与了压力负荷增加所致的大鼠心肌肥厚过程；且CaN在此过程不仅存在活性水平改变，还存在基因和蛋白水平的调节［6］。CalpainⅠ作为一种Ca2+依赖性的半胱氨酸蛋白激酶，通过对多种底物酶的剪切活化，从而在心肌细胞凋亡、心肌肥厚中发挥作用［7］。本实验发现，手术组肥厚心肌中CalpainⅠ蛋白表达水平显著高于假手术组；美托洛尔组大鼠LVW/BW较手术组显著下降的同时，CalpainⅠ蛋白表达下降，提示CalpainⅠ也参与了腹主动脉缩窄、压力负荷增高所致的大鼠心肌肥厚过程。

本实验中美托洛尔组大鼠LVW/BW低于手术组，提示美托洛尔可预防腹主动脉缩窄、压力超负荷所致心肌肥厚。与手术组相比，美托洛尔在预防心肌肥厚的同时，不仅存在心肌CaN mRNA、蛋白质表达下调和CaN活性下降，还存在CalpainⅠ蛋白质表达下调，提示美托洛尔通过调控CalpainⅠ、CaN信号通路预防压力超负荷心肌肥厚的发生。

在培养的心肌细胞中发现，血管紧张素Ⅱ的刺激可诱导CalpainⅠ活化后CaN含自主抑制区的羧基端蛋白水解，致CaN的持续活化［4］。另有对人类心脏的研究发现，两种类型的Calpain（CalpainⅠ和CalpainⅡ）均可以导致CaN含自主抑制区的羧基端降解，致CaN持续活化，提示在心脏中存在Calpain致CaN水解活化的信号通路［8］；且该通路参与了心脏瓣膜病合并糖尿病患者心律失常——房颤的发生过程［9］；Calpain内源性抑制剂 Calpastatin过表达可通过降低Calpain和CaN活性，达到预防氧化应激所致的线粒体损伤和人神经母细胞死亡的作用［10］。

本研究中，手术组肥厚心肌中CalpainⅠ表达上调的同时存在CaN活性增加，美托洛尔组大鼠在心肌肥厚受抑的同时存在CalpainⅠ表达下调，并CaN活性下降，提示美托洛尔可通过抑制CalpainⅠ调控的CaN信号通路预防腹主动脉缩窄大鼠的心肌肥厚。

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