Survivin、COX⁃2和P⁃gp在结直肠癌中的表达及临床意义*

刘振兴，梁金龙，杨雪峰，谢 铭（遵义医学院附属医院胃肠外科，贵州遵义563003）

结直肠癌（CRC）又称大肠癌，是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率居我国消化系统恶性肿瘤的第1位[1]。近年来，随着人口老龄化、饮食习惯及生活方式的改变，CRC的发病率呈逐年上升趋势[2]。其早期症状隐匿、临床发现多属于中晚期、5年生存率低、预后较差，严重威胁着人类的健康[3]。因此，开展CRC的防治研究具有重要意义。CRC的发生与发展是一个极为复杂的过程，为了探讨凋亡抑制蛋白（Survivin）、环氧合酶⁃2（COX⁃2）和 P⁃糖蛋白（P⁃gp）在 CRC 发病过程中的作用，本研究采用免疫组化方法检测Survivin、COX⁃2和P⁃gp在CRC中的表达，并分析其相关性及与临床病理特征的关系，从而为探索CRC新的诊断及防治方法提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1—12月本院60例临床病理资料完整的CRC患者手术标本，取癌组织和其中20例患者的相应正常黏膜组织（距肿瘤大于10 cm）作为研究对象。60例患者中，男31例，女29例；年龄37～80岁，平均（60.2±12.5）岁；所有患者术前均未进行过放化疗等相关治疗，并排除CRC家族史和CRC术后复发者。60例患者均为腺癌，其中肿瘤直径小于5 cm 34例，≥5 cm 26例；中高分化14例，低分化46例；肿瘤浸润未及浆膜层19例，浸润超过浆膜层41例；有淋巴结转移38例，无淋巴结转移22例；CRC TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ期33例。所有标本均经甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。

1.2 方法

1.2.1 试剂与方法 Survivin兔抗人多克隆抗体、COX⁃2兔抗人多克隆抗体、P⁃gp兔抗人单克隆抗体、即用型抗鼠/兔通用免疫组化试剂盒均购自上海基因科技有限公司。采用免疫组化方法（GTVision法）检测，实验操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。

1.2.2 结果判断标准 根据阳性细胞数及阳性信号出现的位置综合判断。Survivin、COX⁃2阳性染色定位于细胞浆和胞膜的棕黄色颗粒，P⁃gp阳性染色定位于细胞膜的棕黄色颗粒。细胞着色强度评分：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞百分数（以 a表示）评分：0为 0分，0＜a≤25% 为 1分，25%＜a≤50% 为 2 分，50%＜a≤75% 为 3 分，75%＜a≤100%为4分；以阳性细胞数计分和着色强弱计分之乘积评定，＞3分者为阳性，≤3分者为阴性。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行分析。计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验；二者的相关性采用 Spearman相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Survivin、COX⁃2和 P⁃gp在 CRC 及正常结直肠黏膜组织的表达情况 Survivin、COX⁃2在CRC内主要表达于细胞质和细胞膜，P⁃gp主要表达于细胞膜。阳性表达结果为棕黄色颗粒（图1～3）。60例CRC组织中Sur⁃vivin蛋白表达阳性43例，表达率为71.7%（43/60）；20例正常大肠黏膜组织内Survivin蛋白阳性表达率为15.0%（3/20），二者比较，差异有统计学意义（χ2=18.287，P＜0.01）；60例 CRC 组织中 COX⁃2蛋白表达阳性40例，表达率为66.7%（40/60）；20例正常结直肠黏膜组织内COX⁃2蛋白阳性表达率为20.0%（4/20），二者比较，差异有统计学意义（χ2=13.119，P＜0.01）；60 例CRC组织中P⁃gp蛋白表达阳性15例，表达率为25.0%（15/60）；20例正常结直肠黏膜组织内P⁃gp蛋白阳性表达率为10.0%（2/20），二者比较，差异无统计学意义（χ2=2.017，P＞0.05）。见表 1。

图1 Survivin在CRC及正常结直肠黏膜组织内表达（400×）

图2 COX⁃2在CRC及正常结直肠黏膜组织内表达（400×）

图3 P⁃gp在CRC及正常结直肠黏膜组织内表达（400×）

表1 CRC、正常结直肠黏膜组织中Survivin、COX⁃2和 P⁃gp 的表达[n（%）]

2.2 Survivin和COX⁃2的表达与CRC临床病理特征的关系 Survivin和COX⁃2二者均与浸润深度、淋巴结转移、肿瘤分期相关（P＜0.05），而与CRC患者性别、年龄、肿瘤大小及分化程度无相关性（P＞0.05）。见表2。

2.3 Survivin和COX⁃2在CRC中表达的相关性分析 43例Survivin蛋白阳性表达的CRC患者中COX⁃2蛋白的阳性表达为34例，17例Survivin蛋白阴性表达的CRC患者中COX⁃2蛋白的阳性表达6例，Spearman相关性分析显示二者呈正相关（r=0.418，P＜0.01）。见表3。

表2 Survivin和COX⁃2异常表达与CRC临床病理特征的关系（n）

表3 CRC患者Survivin和COX⁃2表达的关系[n（%）]

2 讨 论

CRC是我国最常见的消化系统恶性肿瘤之一，严重威胁着人类健康，其发生是一个多因素、多步骤共同参与的复杂过程，而肿瘤患者的预后与其侵袭、转移及对化疗药物的敏感性密切相关[4]。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族（IAPs）的一员，也是目前发现的最强的凋亡抑制因子[5]，含142个氨基酸，相对分子质量为16.5×103。Survivin具有肿瘤特异性表达的特点，其通过抑制Caspase⁃3和Caspase⁃7的活性，从而抑制肿瘤细胞凋亡[6]，促进细胞增殖，并通过对细胞G2/M期的调节，参与细胞周期调控、有丝分裂的过程，导致肿瘤细胞跳过细胞控制点而继续增殖[7]。同时其具有促进肿瘤血管生成作用，参与肿瘤细胞的侵袭、转移等生物学行为[8]。研究报道，Survivin在正常结直肠黏膜中呈无表达或低表达，在CRC组织中呈高表达，且与肿瘤的淋巴结转移和临床分期相关[9⁃10]。本研究结果显示，CRC组织中Survivin蛋白表达阳性表达率为71.7%（43/60），明显高于正常黏膜组织内表达阳性表达率15.0%（3/20），二者比较，差异有统计学意义（χ2=18.287，P＜0.01），其高表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期密切相关（P＜0.05）。提示Survivin可能为CRC特异性表达的一种分子生物学改变，因此可作为CRC早期诊断和评判预后的指标。

COX是催化花生四烯酸转化为前列腺素（PG）的关键酶，COX⁃2是其中一个亚型，在正常组织中无表达，其多种实体肿瘤的增殖、侵袭和转移，并与其预后密切相关[11]。研究表明，COX⁃2也过表达于CRC中，与肿瘤临床分期、浸润深度及淋巴结转移密切相关，并与基质金属蛋白酶⁃2（MMP⁃2）呈协同效应，共同促进CRC的发生与发展[12]。COX⁃2高表达能够促进PGs的合成，从而抑制肿瘤细胞的凋亡[13]。赵亚玲等[14]研究结果表明，塞来昔布能够显著下调COX⁃2蛋白表达水平，从而抑制人红白血病HEL细胞增殖、迁移。COX⁃2可能通过促进细胞增殖和抑制细胞凋亡、诱导肿瘤血管形成、逃避生物体内细胞免疫监视作用等机制发挥抗凋亡作用[15]。本研究结果表明，COX⁃2蛋白在CRC组织中表达阳性表达率为66.7%（40/60），显著高于正常黏膜组织内表达阳性率20.0%（4/20），二者比较，差异有统计学意义（χ2=13.119，P＜0.01），与 Survivin 蛋白表达相同，COX⁃2高表达也与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期密切相关（P＜0.05）。通过进一步分析，COX⁃2与Survivin在CRC组织中的阳性表达呈正相关（P＜0.05），提示二者共同促进了CRC的发生与发展。

P⁃gp是由多药耐药基因1（MDR1）编码的跨膜糖蛋白，是一种腺苷三磷酸（ATP）依赖性外输泵[16]。P⁃gp和ATP结合后，利用ATP供能，将化疗药物泵至细胞外，因此肿瘤细胞内的药物蓄积下降，低于杀伤肿瘤细胞的水平，从而导致细胞产生耐药，这种药物外排机制称为经典的多药耐药（MDR）机制[17]。赵岗等[18]采用Western blotting检测CRC耐奥沙利铂细胞HCT116/L、耐阿霉素细胞LoVo/adr及对应亲本细胞中P⁃gp蛋白表达情况，结果显示在耐药细胞HCT116/L、LoVo/adr中P⁃gp高表达，而在亲本细胞中未检测到其表达。在本研究中，CRC组织内P⁃gp蛋白的表达阳性率25.0%（15/60）与正常黏膜组织内表达阳性10.0%（2/20）比较，差异无统计学意义（χ2=2.017，P＞0.05）。结合患者病史资料进行分析，由于患者术前均未进行过放化疗等治疗，并未产生化疗药物耐药性，这或许是本实验中CRC组织内P⁃gp低表达或无表达的主要原因。

综上所述，本研究通过免疫组化方法，检测了CRC组织与正常黏膜内 Survivin、COX⁃2和 P⁃gp的表达，结果显示在CRC组织内Survivin和COX⁃2明显高表达，而P⁃gp低表达或无表达。Survivin和COX⁃2的异常表达与CRC的侵袭，转移密切相关，进一步分析表明二者的表达呈协同效应，提示二者共同促进CRC的发生与发展。通过研究其与CRC临床特征的关系，可为CRC的诊治及判断预后提供新的理论依据。

[1]ZHENG R，ZENG H，ZHANG S，et al.National estimates of cancer prevalence in China，2011[J].Cancer Lett，2016，370（1）：33⁃38.

[2]徐玉彬，张培建，王超臣.结直肠癌的病因及发病机制的研究进展[J].中华临床医师杂志，2015，9（15）：2912⁃2915.

[3]DAVID KA，UNGER FT，UHLIG P，et al.Surgical procedures and postsurgical tissue processing significantly affect expression of genes and EGFR⁃pathway proteins in colorectal cancer tissue[J].Oncotarget，2014，5（22）：11017⁃11028.

[4]孙荣，姚健，杨志.结直肠癌患者的临床特征及预后影响因素[J].中国肿瘤临床与康复，2015，22（12）：1420⁃1422.

[5]CHENG XL，LI MK.Effect of topiramate on apoptosis⁃related protein expression of hippocampus in model rats with Alzheimers disease[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2014，18（6）：761⁃768.

[6]NIU Y，LI JS，LUO XR.Enhancement of expression of survivin promoter⁃driven CD/TK double suicide genes by the nuclear matrix attachment region intransgenicgastriccancercells[J].Gene，2014，534（2）：177⁃182.

[7]BOYKIN C，ZHANG G，CHEN YH，et al.Cucurbitacin Ⅱa：a novel class of anti⁃cancer drug inducing non⁃reversible actin aggregation and inhibiting survivin Independent of JAK2/STAT3 phosphorylation[J].Br J Cancer，2011，104（5）：781⁃789.

[8]张鑫，郝玉琴.靶向survivin shRNA在肿瘤治疗中的研究进展[J].中国麻风皮肤病杂志，2016，32（1）：58⁃60.

[9]王林娜，侯素平，刘洪博，等.结直肠癌中REG4与survivin的表达及临床意义[J].实用医学杂志，2015，31（20）：3347⁃3350.

[10]薛军，武雪亮，高晓斌，等.结直肠腺癌组织survivin和Ki⁃67的表达及其与预后的关系[J].基础医学与临床，2015，35（11）：1526⁃1530.

[11]ABDELAAL ASMAA A，AFIFY RA，ZAHER AE，et al.Study of prognostic significance of marrow angiogenesis assessment in patients with de novo acute leukemia[J].Hematology，2015，20（9）：504⁃510.

[12]卢国丰，陈军，刘菊林，等.COX⁃2和MMP⁃2在结直肠癌中的表达及其意义[J].胃肠病学，2014，19（10）：596⁃598.

[13]王志强，黄述斌，李松梅，等.环氧合酶⁃2及表皮生长因子在结直肠肿瘤中的表达及意义[J].安徽医学，2015，36（11）：1361⁃1363.

[14]赵亚玲，刘贵敏，梁文同，等.COX⁃2抑制剂对人红白血病HEL细胞增殖，凋亡及迁移的影响[J].南京医科大学学报（自然科学版），2016，36（4）：435⁃439.

[15]MISRA S，SHARMA K.COX⁃2 signaling and cancer：new players in old arena[J].Curr Drug Targets，2014，15（3）：347⁃359.

[16]冯慧玲，熊玉卿.与P⁃糖蛋白及MDR1基因关联的药物转运研究现状[J].中国临床药理学杂志，2014，30（11）：1062⁃1064.

[17]张剑虹，张飞，张晓丽，等 .CerbB⁃2、MDR1/P⁃gp 蛋白在乙状结肠黏液腺癌中的表达及意义[J].河北医药，2015，37（10）：1454⁃1457.

[18]赵岗，郑泰浩，黄秀，等.结直肠癌中microRNA⁃451部分逆转MDR1/P⁃gp途径介导的多药耐药[J].第三军医大学学报，2016，38（2）：155⁃160.