儿童期重症肌无力外周血Th17相关细胞因子的水平

肖君，张函，何丹，谢敏杰，王伟

重症肌无力是一种T细胞依赖、自身抗体介导的获得性自身免疫性疾病，主要表现为神经肌肉接头处的神经冲动的传递障碍，从而导致波动性的骨骼肌无力[1]。儿童期重症肌无力是指发病年龄＜15岁的重症肌无力，其临床表现有其自身的特点，如单纯眼肌型等[2]。不同的临床特点提示儿童期重症肌无力可能有独特的发病机制。既往研究数据显示，和高加索人相比，亚洲人儿童期重症肌无力的发病率明显较高[3]。由于在高加索人中的发病率低，因此针对儿童期重症肌无力的研究少之又少。

多项研究证实，Th细胞功能异常在重症肌无力的发病中起重要作用[4]。Th17细胞是由幼稚的CD4+T细胞分化而来，Th17相关细胞因子包括IL-17、IL-21、IL-22、IL-23等[5-8]。其中，IL-17A是Th17细胞的标识性细胞因子，由活化的记忆T淋巴细胞产生，在许多自身免疫性疾病的发病过程中起重要作用[9]；而IL-23促进Th17细胞的存活，使活化的Th17细胞持续表达IL-17A[6,8,10]。有研究表明，Th17相关细胞因子在合并胸腺瘤的重症肌无力患者中的水平明显升高，提示其在重症肌无力的发病中扮演重要角色[11,12]，但它是否参与儿童期重症肌无力的发病过程尚不清楚。本研究旨在研究Th17相关细胞因子在儿童期重症肌无力中的水平及其在儿童期重症肌无力发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月至2015年6月期间在同济医院神经内科门诊就诊的儿童期重症肌无力患者60例为试验组（CMG组）；诊断标准主要参照美国临床分类协会发布的诊断标准及中华神经医学会神经病学分会神经免疫学组及中国免疫学会神经免疫学分会发布的《中国重症肌无力诊断和治疗专家共识2011版》[13,14]，包括：①波动性的眼外肌、咽喉肌或四肢近端肌肉等横纹肌无力及易疲劳，症状疲劳后加重，休息或胆碱酯酶抑制剂治疗后减轻；②新斯的明试验阳性；③疲劳试验阳性；④乙酰胆碱受体抗体检测阳性；⑤肌电图重复神经电刺激提示动作电位波幅第5波比第1波在低频刺激（3～5 Hz）时递减10%以上；⑥如果上述步骤仍不能明确诊断，则进行胆碱酯酶抑制剂诊断性治疗以明确。参加门诊体检的年龄和性别相匹配的健康儿童50例为正常对照组（HC组），并排除急慢性感染和自身免疫病等系统性疾病。所有研究均已得到本院伦理委员会的批准，参与儿童均由监护人签署知情同意书。

1.2 主要试剂与材料

IL-23 ELISA试剂盒及人IL-17A超敏ELISA试剂盒（购于美国eBioscience公司）；IL-12/IL-23 p40 ELISA试剂盒（购于美国R&D systems公司）；台式低温高速大容量离心机（购于德国Eppendorf公司）；酶标仪（购于瑞士Tecan公司）。

1.3 方法

2组的相关辅助检查，如胸腺MRI/CT平扫、甲状腺功能检测（FT3、FT4、TSH）等均于初次就诊时在同济医院检验科进行，血乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，AChR）抗体检测于武汉康圣达医学检验所进行。

1.3.1 外周血提取及处理 抽取受试者肘部或头皮静脉血4～5 mL于促凝剂采集管中，室温静置30 min，于低温高速离心机中以4℃ 3 000 r/min的速度离心15～20 min，获取上层血清，用高压消毒过的1.5 mL EP管分装（120 μL/管），于－80℃冰箱保存，避免反复冻融。所有受试儿童在抽血当日均无发热或感染的临床表现，所有外周血标本均未发生溶血。

1.3.2 外周血IL-23,IL-12/23p40及IL-17A ELISA检测 ELISA检测按照各ELISA试剂盒操作说明书进行，每个标本取100 μL血清标本，分别检测2组外周血血清中IL-23、IL-12/23p40及IL-17A的水平。具体步骤：取出－80℃低温冰箱中的外周血血清样本及4℃冰箱中的ELISA试剂盒，所有样本及试剂在使用前均回复至室温；配制标准品，在ELISA酶标板中分别加入标准品、空白对照或样本，均设置复孔。贴纸覆盖，室温孵育，后洗脱，每孔内加入配好的二抗，用贴纸覆盖酶标板，室温孵育；再经过洗脱、显色，终止液终止反应后，快速放入酶标仪上读取各孔OD值，以标准品及空白对照的浓度作为横坐标，相应OD值作为纵坐标，绘制标准曲线，依据样品的OD值，应用Curvexpert软件计算出相应细胞因子的浓度。

1.4 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件进行数据统计分析，计量数据以（均数±标准差）表示；独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料

CMG组60例患儿中，男26例，女34例，男女比约为3∶4；平均年龄（6.8±3.4）岁。HC组50例，男26例，女24例；平均年龄（8.2±1.2）岁。2组年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05）。

CMG组中患儿的发病年龄在4岁前25例（41.7%，男11例，女14例），4～7岁发病19例（33.7%，男10例，女9例），7～15岁发病16例（26.7%，男5例，女11例）；AChR抗体阳性42例（70.0%，男19例，女23例）；通过胸部CT/MRI检查，所有病例均未发现胸腺瘤，合并胸腺增生10例（16.7%，男4例，女6例），其中行胸腺切除手术3例（男1例，女2例）；胸腺正常50例（83.3%，男22例，女28例）；根据患者临床表现及甲状腺功能检查结果，合并甲状腺功能亢进6例（10.0%，男3例，女3例）。

2.2 外周血IL-17A、IL-23及IL-12/23 p40 ELISA检测结果

CMG组和HC组的外周血血清中IL-17A浓度分别为（3.17±0.12）ng/mL、（1.36±0.16）ng/mL，CMG组外周血血清中IL-17A含量高于HC组，差异有统计学意义（P＜0.05）。CMG组和HC组的外周血血清中IL-23含量分别为（9.83±1.11）pg/mL、（3.96±0.28）pg/mL，CMG组的血清IL-23浓度是HC组的近3倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。CMG组和HC组的血清IL-12/23 p40表达量分别为（178.49±10.37）pg/mL、（109.78±9.21）pg/mL，CMG组较HC组血清IL-12/23p40含量明显升高，有显著性差异（P＜0.01）。

3 讨论

重症肌无力是一种T细胞依赖、自身抗体介导的获得性自身免疫性疾病，症状可波及眼外肌和其他骨骼肌。儿童期重症肌无力以单纯眼肌型多见。既往数据显示，在中国，39%～50%以上的重症肌无力患者在15岁以前发病[15,16]，而在高加索人当中，重症肌无力主要在成年期发病，青春期发病的仅占10%～15%[17]。本研究纳入60例儿童期重症肌无力患者，4岁之前发病的占47.1%。笔者推断，中国儿童期重症肌无力的发病年龄＜4岁者，即婴儿期发病居多，且其比例远远高于高加索人，这一结论与既往研究相符。CMG组的外周血AChR抗体阳性率为70%，与报道的成人重症肌无力患者AChR抗体阳性率相比略低，但是高于欧美等国家儿童期重症肌无力的抗体阳性率[6,8]，提示其可能具有独特的免疫发病机制。

近期研究表明，在重症肌无力的发病过程中，细胞免疫发挥重要的作用[18]。Th17细胞是新发现的一个辅助性CD4+T细胞亚群，Th17相关细胞因子在多种自身免疫性疾病，如克罗恩病、多发性硬化、系统性红斑狼疮及类风湿性关节炎等的发病过程中起重要作用[9,19-21]。其中，IL-17A作为首个被发现的Th17相关细胞因子，可以上调基质金属蛋白酶和一些趋化因子的水平，募集中性粒细胞，从而发挥促炎因子的作用，进而参与自身免疫反应的发生[22]。为了验证IL-17A在儿童期重症肌无力中的具体作用，本研究通过ELISA检测CMG组及HC组外周血中IL-17A的表达水平，发现外周血血清中IL-17A在CMG组中明显增加。此外，Th17相关细胞因子IL-23是IL-12家族的新成员，由IL-12/23 p40和IL-23p19这两个亚基组成，通过活化的树突状细胞来调节T细胞依赖的免疫应答。研究表明，IL-23主要是通过刺激Th17细胞分泌Th17相关细胞因子如IL-17A和IL-17F发挥作用[23]。IL-23能维持Th17细胞的稳态和扩增，促进其持续分泌IL-17A，是其赖以生存的必需的细胞因子[6,8,10]。Schlapbach等[24]通过免疫组织化学及半定量PCR发现，在化脓性汗腺炎患者的皮损处，乳头层和网状真皮层均有IL-23和IL-17A的表达，且表达水平较正常皮肤升高，提示Th17相关细胞因子可能参与该病的免疫病理过程。He等[25]的研究结果显示，在超敏性气道炎症患者中，通过上皮途径吸入后的抗原可促进树突状细胞产生IL-23，并使IL-17A表达增加。本研究通过ELISA检测，发现CMG患者血清中IL-23及其活性亚单位IL-12/23p40的含量较HC组明显升高，表明IL-23可能参与儿童期重症肌无力的发病。

综上，本研究发现，中国儿童期重症肌无力以婴儿期发病居多，且在患儿外周血血清中IL-23、L-12/23p40及IL-17A的水平明显升高，提示Th17相关细胞因子可能参与儿童期重症肌无力的发病过程。

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