干细胞治疗肝脏疾病研究进展*

李珊珊，洪丰综述，陈煜审校

干细胞基于其具有自我更新、高度增殖及多向分化的潜能，使得干细胞基础及转化医学研究成为当前国际上最受关注的领域之一，随着干细胞技术的不断发展，干细胞分离、培养、移植等方面取得了突破性进展，并应用于越来越多疾病的治疗，包括中枢神经系统疾病、心肌损伤、骨关节炎、黄斑变性、糖尿病、肝脏疾病、肿瘤等[1]。作为一种新的医疗技术，已有大量关于干细胞治疗肝脏疾病的研究报道，初步验证了其治疗的一定有效性及安全性，虽然多数研究仅限于细胞、动物水平，实现临床转化仍有待多重考验，但相信随着研究技术、内容的丰富及深入，干细胞有望实现肝病治疗的临床转化，为肝病尤其是终末期肝病的治疗带来新的希望。本文就相关干细胞的分类、细胞培养移植、体内示踪及肝病治疗等的近期研究进展进行综述。

1 治疗肝病相关干细胞

目前研究显示，多种干细胞在肝损伤中发挥作用，可能用于治疗肝脏疾病，其中包括肝干细胞（hepatic stem cells，HSCs）、胚胎干细胞（embryonic stemcells，ESCs）、诱导型多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），外周血干细胞（peripheral blood stemcells，PBSCs）等。

1.1 HSCs 肝干细胞属于成体干细胞，存在于肝脏内，主要包括肝卵圆细胞（hepatic oval cell，HOC）和小肝细胞样祖细胞（small hepatocyte-like progenitor cell，SHPC），其中 HOC 的特点是胞体小，核大而胞质少，呈卵圆形，可双向分化为肝细胞或胆管上皮细胞。SHPC形态介于干细胞和胆管细胞，通常成体HOC先分化为SHPC后再分化为成熟干细胞，多数学者认为HSCs是位于门静脉周围及终末胆管hering管中[2]，近期有国外研究[3]发现HSCs位于中央静脉周围，需要Wnt信号来维持干性，而中央静脉内的血管内皮细胞负责释放Wnt分子进入组织，如果干细胞离开Wnt信号的覆盖范围，便会迅速失去了分裂新干细胞的能力，从而分化为成熟的肝细胞。肝干细胞因其具有定向分化为肝细胞及胆管细胞的优势，且不存在伦理问题，是较为理想的治疗肝脏疾病的干细胞，但目前国内外罕见有关人源性肝干细胞系的报道。我们课题组已经从成体肝脏中成功分离出人肝干细胞，并建立了可以稳定传代至50代的成体人肝源性干细胞系HYX1，目前已初步应用于动物试验中[4]。

1.2 ESCs 胚胎干细胞从受精卵内胚层中取得，属高度未分化，是增殖能力最强的全能干细胞，在体外相应的诱导培养条件下，ESCs可分化为成熟肝细胞，将小鼠ESCs移植到肝损伤小鼠模型体内，观察小鼠肝脏内可见大量移植细胞并呈现增殖状态[5]。ESCs的无限增殖能力和分化的多潜能性，在肝脏疾病中有极高的基础与临床研究价值，但ESCs的伦理争议、免疫排斥及致瘤风险等问题限制了其在临床疾病治疗中的研究及应用。

1.3 iPSCs 诱导多能干细胞是来源于成体细胞经病毒载体重新编程而获得的具有干细胞特征的细胞，具有ESCs类似功能，但同时又避免了ESCs的伦理争议和免疫排斥问题，有助于解决肝细胞来源问题，一直以来是再生学领域研究的热点，但部分学者考虑iPSCs的重编程及高度自我更新、多向分化的特征使其具有增加突变及致瘤风险，近期一项研究[6]通过对比分析iPSCs和亚克隆复制的细胞，发现iPSCs中的大多数突变并不会在重编程或者iPSCs产生过程中发生，认为iPSCs是相对稳定的，可在基础与临床研究中安全使用。近年在经典iPSCs重编程基础上发展了一种新的编程技术叫做谱系重编程，即绕开了iPSCs实现谱系内或谱系间细胞类型的转化。王韫芳团队通过该技术，利用小分子化合物而非转录因子将消化道上皮细胞重编程为诱导人内胚层祖细胞（human induced endodermal progenitor cells，hiEndoPCs），hiEndoPCs在体外可分化为表达成熟肝细胞，并能整合到实验小鼠肝脏中，这为肝脏疾病尤其是终末期肝病的治疗研究提供了更为安全有效的新型种子细胞来源[7]。

1.4 MSCs 间充质干细胞是可从骨髓、脂肪组织、脐血、胎盘等组织中分离获得的多能干细胞，属成体干细胞，其中在肝病基础与临床中骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-BMSCs）和脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs）及脐血干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）研究较多。MSCs在体内外特定的诱导条件可分化为多种成体成熟细胞，多项研究[8，9]指出MSCs能在生长因子、细胞因子、肝细胞或非实质肝细胞等的作用下分化为肝样细胞，并参入肝脏疾病中免疫调节、细胞增殖及损伤修复等，MSCs因其来源较为丰富、取材方便、易于培养、低免疫源性并不伴伦理争议，结合目前日益发展的细胞及分子示踪技术，有望成为肝脏疾病中干细胞研究的理想种子细胞来源。

1.5 PBSCs 外周血干细胞是外周血中唯一CD34阳性的细胞，在正常情况下数目非常少，经集落刺激因子动员后迅速增多，收集后可用于疾病的治疗，其在血液系统疾病治疗中的应用较为成熟，近年发现也可用于肝损伤的治疗[10]，但目前肝病中应用PBSCs治疗的研究主要集中在其对症状、预后改善上，其中的具体机制及其治疗的稳定性等研究甚少，PBSCs是否是理想的细胞来源有待进一步验证。

2 干细胞培养移植方法

在干细胞治疗肝病相关研究中，不同培养状态的干细胞可通过不同途径的移植到达实验动物模型或人体体内，从而发挥相应的作用。目前体外干细胞主要在二维培养条件下进行增殖和分化，虽具有易操作、低费用等优点，但细胞在形态、结构和功能方面都与在体内生长状态有显著差异，通常会导致体内实验不能重复体外实验结果，为尽可能模拟体内细胞的生长状态，使细胞能够在立体空间培养增殖，近年来三维培养技术在干细胞培养中受到广泛研究及关注[11-12]，包括需要支架的和不需要支架的三维培养技术，目前常见的三维细胞支架有胶原、水凝胶、聚合物纤维支架等，随着3D生物打印及相关技术发展，三维支架种类层出不穷，为干细胞研究提供了更为有效的培养体系。非支架三维培养技术主要是通过物理方法使细胞处于悬浮状态，主要有微载体、悬滴板、磁悬浮等技术。近期国外有研究[13]利用微流控技术，以水/水/油双乳化作为模板培养肝细胞及成纤维细胞，从而在“小水滴”中构建出微型3D肝模型，此培养模式在干细胞中可能也有一定的借鉴价值。将培养的干细胞移植入动物或人体体内，分别主要通过以下途径：经外周静脉（如鼠尾静脉、眼底静脉丛）、门静脉、肝动脉注射输入，以及向腹腔内、肝脏内、脾脏内直接注入等。

此外还有一些较为新颖的培养移植方式，日本近期一项研究[14]将人诱导多能干细胞衍生肝细胞样细胞（human inducedpluripotent stem cell derived hepatocyte-like cells，iPSHLCs）培养在生物材料上形成细胞片，随后将细胞片附着于肝衰竭小鼠的肝表面来发挥抗肝损害作用，同时与脾内移植途径相比，提示该方法减少了肝脏以外器官的意外移植风险。有研究[15]在体外通过共同培养人源性iPSC、间质祖细胞及内皮祖细胞，诱导形成了肝芽样结构（微型肝），进而异位移植于免疫缺陷小鼠腹腔内来发挥一定肝脏代谢作用。更有将干细胞植入脱细胞化的肝脏中，利用其基质骨架、血管网结构，有助于支持肝干细胞的分化成熟和成熟细胞的存活[16]。总结上述研究发现不同培养方式，不同时期、不同次数及不同途径移植，产生效果都会有所不同，且各有优劣，选择适宜的培养移植方案及研究更好的方案，最大限度使干细胞发挥原有甚至更好的功能，也是目前干细胞研究任务之一。

3 移植干细胞示踪

为了更好的了解干细胞植入、分布、存活、迁移、分化及功能等情况，干细胞示踪技术[17]在此尤为重要，常见有荧光染料标记、核酸标记、报告基因转染标记等，均属于病理示踪，难以在活体状态下分析，而光学成像、核素显像、磁共振成像等技术可实现活体体外示踪。以下为其中三种较为常见的示踪方法：1.细胞膜荧光染料标记，如红色荧光染料PKH26，能与细胞膜的脂质区稳定结合，且对所标记细胞的生物活性和增殖能力没有影响，能高效追踪移植的细胞，但荧光染料会随着干细胞增生分化而稀释淬灭，故仅适用于短期细胞追踪研究；2.慢病毒绿色荧光蛋白转染，通过慢病毒载体介导的基因修饰使干细胞高效稳定表达绿色荧光蛋白，能较好的对移植干细胞进行示踪，但转染后对细胞的生物学特征可能有所影响，具体应用时有待对比监测；3.超顺磁氧化铁纳米颗粒标记移植细胞的磁共振成像技术[18]，是较为新颖的技术，通过细胞标记与体外核磁共振成像联合，可更加有效的实现对移植干细胞的无创性活体示踪。此外还可以根据研究需要将多种示踪途径进行联合，实现了更加精确的病理及活体示踪监测。

4 干细胞与肝脏疾病治疗

4.1 肝功能衰竭 肝衰竭是由多种原因引发的肝功能严重障碍或失代偿临床症候群，病死率极高，目前内科及人工肝治疗只能姑息对症，肝移植是最终唯一有效的办法，但肝移植受肝源、费用限制，迫切需要寻找新的有效治疗方法。干细胞因其自我更新和分化潜能为肝衰竭的治疗提供了新的方向，近年来有较多相关研究报道。意大利研究者[19]首次报道利用人源性肝干细胞治疗LPS/D-半乳糖诱导的暴发性肝衰竭小鼠模型，人肝干细胞可缓解模型小鼠肝细胞凋亡、促进肝细胞增殖，从而起保护作用。我们课题组通过腹腔移植成体人肝源性干细胞能显著减轻刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）诱导的小鼠急性肝损伤，并揭示了移植治疗的最佳时机及作用时间[4]。日本一项研究[14]将体外培养的人源性iPS-HLCs细胞片附着在四氯化碳诱导的急性肝衰竭小鼠肝脏表面，通过该细胞片分泌肝细胞生长因子的机制发挥保护作用。国内一项研究[20]利用人BM-MSCs肝内移植成功救治暴发性肝衰竭大型动物（猪）模型，其间通过大规模抗体芯片、全基因测序、蛋白质谱分析等新技术，阐述移植人BM-MSCs与宿主间相互作用规律，结果发现植入干细胞可明显抑制暴发性肝衰竭中致命性细胞因子风暴，通过旁分泌抑制机体炎症介质分泌、调节免疫反应等，缓解肝脏损伤，最终促进肝脏再生修复，并揭示DLL4（delta-like ligand 4）分子在干细胞移植对肝组织修复中发挥了重要作用。在慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）中干细胞治疗研究相对偏少，2012年一项研究[21]评估了乙型肝炎病毒相关的ACLF患者的UC-MSCs治疗的安全性和初始疗效，共纳入43名ACLF患者，24例患者接受UC-MSCs治疗，19例患者接受盐水对照治疗，以4周间隔给予UC-MSCs治疗3次，在48周或72周评估发现UC-MSCs可改善ACLF患者病情，显著增加生存率，并验证其治疗具有一定的安全性。有研究[15]通过体外共培养人源性iPSC、间质祖细胞及内皮祖细胞，诱导分化成肝芽样结构（微型肝），再通过异位移植途径植入于免疫缺陷小鼠腹腔内，血管生成后可刺激肝细胞成熟，能显著改善化学药物诱导的肝衰竭小鼠的预后，考虑该肝芽可作为肝外来源的肝脏支持系统提供潜在的治疗作用。总结上述研究，干细胞移植治疗肝衰竭主要机制在于免疫调节或产生相关细胞因子及生长因子抑制炎症、促进残存肝细胞增殖、组织修复等，有效性及安全性初步明确，但目前尚缺乏大规模、长期随访的临床试验研究。

4.2 肝硬化 我国肝硬化发病率逐年增高，失代偿期患者内科治疗效果欠佳，病情易反复并逐渐加重，生活质量极差，近年干细胞移植治疗肝硬化也初见成效。一项多中心、随机研究中[22]通过自体BM-MSCs动脉输入移植治疗72例酒精性肝硬化患者，观察可在组织学水平改善肝脏纤维化，改善肝功能水平，并证实具有安全性。国内一项回顾性研究[23]观察人UC-MSCs治疗失代偿性乙型肝炎肝硬化的安全性与疗效，入组乙型肝炎肝硬化失代偿期患者60例，对照组120人，发现经UC-MSCs治疗后可改善治疗组患者胆碱酯酶及白细胞水平，降低Child-Pugh评分，且具有安全性，分析可能机制为UC-MSCs移植后能够归巢并定植到病损的肝组织，刺激肝细胞增殖，修复受损的肝组织，抑制肝纤维化，但其中具体分子机制尚不明确。有关干细胞治疗肝硬化患者的效果、远期安全性有待进一步探讨及验证。

4.3 肝癌 干细胞在肝癌治疗中的研究目前较少，日本一项研究[24]指出，干扰素β（interferon-β，IFN-β）具有抗癌作用，但因体外易快速失活，组织穿透性差，导致该药物不能得到广泛使用，可用人源性诱导多能干细胞来源的骨髓细胞（iPS cell-derived myeloid lineage cells，iPS-ML） 来表达IFN-β，经腹腔注射iPS-ML给肝癌小鼠模型后，可缓解小鼠肿瘤的进展，延长存活时间。提示iPS-ML可作为药物运输系统，可能会对肝癌病人有治疗价值。这项研究为肝癌的治疗提供了新的思路，对肝癌治疗研究有很好的启发性。

4.4 非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD） 目前该病在全世界发病率逐年增加，是一种被严重低估的慢性肝损伤疾病，疾病最初可仅表现为脂滴累积，但随着疾病进展，会逐渐发展为非酒精性脂肪肝炎，甚至发展至肝硬化、肝癌。干预治疗除饮食控制、运动，降血脂等之外，目前尚无效果明确的针对性药物，近期有两项体内实验研究[9，25]显示干细胞移植有助于改善非酒精性脂肪肝，将大鼠脂肪组织分离的AD-MSCs通过门静脉移植给高脂肪饮食诱导的NAFLD大鼠，与对照组相比，模型大鼠肝脏组织病理提示肝损伤缓解、脂质累积减少，血清促炎因子，肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6水平下调，即通过改善肝功能、促进脂质代谢、减轻氧化应激来帮助NAFLD的逆转，从而发挥肝保护作用。据此干细胞移植可能是NAFLD新的潜在治疗策略。

4.5 自身免疫性肝病 该病在我国患病率逐年增加，临床中治疗手段有限，且一定数量的患者对内科针对性的治疗反应欠佳，寻找新的治疗方法一直是自身免疫性肝病研究的方向之一。有研究发现[26]对熊去氧胆酸治疗应答不佳的原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）患者予 UC-MSCs移植治疗，可缓解患者的乏力及瘙痒症。10例对熊去氧胆酸治疗应答不佳的PBC患者接受异基因骨髓MSCs治疗后，外周淋巴细胞中CD8+T细胞数量减少，同时CD4+CD25+Foxp3+T细胞增多，肝功能指标改善，且治疗过程安全[27]。另有研究发现[28]间充质干细胞可通过激活程序性死亡-1（programmed death 1，PD-1）通路，发挥免疫抑制作用，改善自身免疫性肝炎小鼠的肝损伤。这些研究均提示干细胞移植可改善免疫反应从而改善自身免疫性肝病肝损伤。

5 总结

干细胞移植作为肝脏疾病新的治疗手段受到广泛的关注，目前已初步验证其具有一定的有效性及安全性，但有关远期疗效及安全性、相关干细胞发育分化调控机制、在肝脏疾病治疗的临床转化及作用的具体机制尚不明确，仍有非常多的难题亟待解决，但相信随着干细胞相关领域如干细胞分离、基因重组、培养、移植、示踪、构建生物人工肝、组织工程化肝脏等研究的不断突破，干细胞移植这一技术终会真正应用于临床肝脏疾病的治疗。正如iPSC创始人、诺贝尔奖获得者山中伸弥今年在《纽约时报》专访中所说“干细胞距离临床应用依然需要时间和金钱”。

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