上转换发光技术侧流免疫夹心法检测麻风患者和家庭接触者PGL-I抗体水平

张信辉 杨梨丽 杨 琴 赵廷芳 杨昌明 戴 乾 元 康 翁小满 温 艳 Anouk. van Hooij Paul Corstjens Annemieke Geluk 赖雅芳 付 云 李进岚

麻风分枝杆菌(Mycobacterium Leprae, ML)是麻风的病原体，麻风是严重影响人类身心健康的疾病。目前早诊断与早治疗依然是控制麻风的基石，涂片查菌阳性率低和缺乏特异性延迟了麻风早期诊断及治疗。但因多菌型(MB)麻风患者细胞免疫力缺陷，体液免疫力与正常人接近，而少菌型(PB)与MB相反，造成免疫检测困难[1]；另 ML 抗原大多与结核分枝杆菌(Mtb)、 非结核分枝杆菌(NTM)有交叉反应，也限制了免疫诊断的发展。目前诊断的麻风病人，通常发现较晚，即使采用了有效的联合化疗(MDT)，依然有相当多的治愈病人因麻风病所致神经损伤而造成畸残[2]。早期发现并及时治疗麻风病，是切断传播途径、减少麻风致残的先决条件。从麻风患者的家属(家内接触者)中监测到临床极易忽略的早期感染者及潜在的麻风患者十分困难。麻风患者PGL-I血清水平与细菌指数(BI)相关[11]，通过对PGL-I抗体检测结果的分析，密切监测PGL-I抗体水平的变化，评估发病风险。本研究旨在判断该实验对疾病发病的预测价值，并提供一种新的诊断麻风感染的有效诊断方法。

1 材料和方法

1.1 UCP-LFA反应管及检测试剂由本项目合作单位(荷兰莱顿大学医学中心传染病研究所)Annemieke GelukA教授自主研发[9，10]。项目期间在麻风流行地区采集下列研究对象肝素抗凝全血标本进行UCP-LFA检测分析：①未服药的新确诊麻风患者(排除复发患者)60例；②患者家属(与麻风患者共同生活半年以上)87名；③正常人(与麻风患者无共同生活史)56名。

1.2 采集肝素抗凝全血，3 h内分装在反应管内(每管全血1 mL以上)，即刻放入37℃水浴箱孵育20～24 h，孵育结束后转存-20℃以下冰箱待检。

1.3 ①测试前，将反应管内的样本室温解冻，4500 g离心10 min。②吸取上清液(4 uL)至96孔稀释板中(每孔预加200 uL buffer)，避免吸到细胞层，按标本编号顺序排列。③将显色剂(UCP)水浴超声振荡器处理后每孔加2 uL；④将PGL-1检测试纸条(批号：170405)放入稀释板各样本孔中，直至试纸条干燥。⑤用LUMC(Leiden University Medical Center)结果判读仪逐个读取检测结果(相对荧光单位 RFUs),并计算T/FC比值以判断阴阳性。

2 结果

本次研究样本共203份，其中患者60份，家内接触者87份，正常对照组56份，检测失败2份，有效结果共201份。

2.1 临界值确定 根据labrox结果判读仪(LUMC)读取的检测值和计算的ROC曲线来确定临界值。测试线和流量控制线的波峰面积比(R)，Windows下GraphPad Prism version 7.00软件(GraphPad Software，拉霍亚加利福尼亚，美国)计算Youden指数确定最佳试验界限(图1)。经计算将临界值确定为0.29。

计算ROC曲线(receiver operating characteristic curve)以评估PGL-I的诊断潜力，区分麻风病人、家内接触者和健康人。PGL-I能区分LL/BL 、BT/TT患者和EC、HHC(图2)，显示出对BL/LL患者有极好的显著性，对BT/TT患者有良好的显著性(表1)。

表1 曲线下面积的显著性(AUC)

2.2 PGL-I IgM阳性率

2.2.1 按患者、家内接触者和正常对照分组，计算PGL-I IgM阳性率，其阳性率分别为81.4%、5.7%和1.8%。患者组PGL-I IgM阳性率明显高于其余两组，家内接触者组PGL-I IgM阳性率又明显高于正常对照组。三组之间差异有统计学意义(χ2=126.47,P<0.005)，见图3。

2.2.2 按少菌型(PB)和多菌型(MB)分组计算PGL-I IgM阳性率，其阳性率分别为44.5%和89.4%。MB患者PGL-I IgM阳性率明显高于PB患者。两组间差异有统计学意义(χ2=11.181,P<0.005)，见图4。1例未定型麻风(I)未纳入分析。

2.2.3 按BI值阴阳性对患者分组， BI+、BI-患者其PGL-I IgM阳性率分别为83%、0%。BI+ 组PGL-I IgM阳性率明显高于BI- 组。两组之间差异有统计学意义(χ2=17.560,P<0.005)，见图5。

图1 检测线(T)一个正信号(a)和一个负信号(b)；流量控制(FC)峰值为内部对照图2 ROC曲线以评估PGL-I的诊断潜力，区分麻风病人、家内接触者和健康人图3 麻风患者、家内接触者和正常对照分组PGL-I IgM阳性率

图4 不同型别PGL-I IgM阳性率

图5 BI值阳性与阴性者的PGL-I IgM阳性率

3 讨论

研究结果显示，患者、家内接触者、正常对照组PGL-I IgM阳性率分别是81.4%、5.7%和1.8%。患者组PGL-I IgM阳性率明显高于其余两组，家内接触者组PGL-I IgM阳性率又明显高于正常对照组。三个组别之间的差异有统计学意义(χ2=126.47,P<0.005)。多菌型(MB)PGL-I IgM阳性率(89.4%)明显高于少菌型(PB)(45.5%)。三个组之间差异有统计学意义(χ2=11.181,P<0.005)。虽然少菌型(BT/TT)患者中检测IgM类抗体阳性率不高，不能用于人群筛选，但可用于:为治疗目的区分MB和PB[4，12]；早期预测复发或发病[4,5]；在高危人群(如家内接触者)中发现发病危险者。按BI值阴阳性对患者分组， BI+、BI-患者其PGL-I IgM阳性率分别为83%、0%。BI+组PGL-I阳性率明显高于BI-组，两个组之间差异有统计学意义(χ2=17.560,P<0.005)，其他学者的研究结果亦表明血抗麻风分枝杆菌IgM类抗体的水平与BI呈线性相关[11]，故在麻风患者家内接触者中检出PGL-I IgM抗体水平高的个体，对该个体的发病风险评估具有重要意义。

家内接触者PGL-I IgM检测阳性(T/FC比值>0.29)5例(5/87)，其中，3例为父/母子，2例为夫妻，接触的患者4例为多菌型(BL/LL)、1例为未定型麻风；另有5例家内接触者PGL-I IgM检测值偏高(T/FC比值=0.25～0.29),其中，3例为父/母子，1例为夫妻，1例为兄弟，且接触患者均为多菌型。家内接触者几乎与麻风患者共同生活,有极易被感染的环境条件,一些早期发现麻风有家族聚集现象的学者,证实遗传因素在麻风病学中起到重要作用,由于在这些易感家族中有相同的易感因素和相同的生活环境,故他们患麻风的危险性较无亲属患麻风的人群高[8]。也有研究表明，多菌型接触者中PGL-I抗体阳性者发病危险性比阴性高8倍以上[3,4,6,7]。故本次筛查发现的5例PGL-I IgM阳性及5例PGL-I IgM检测值偏高的接触者，可视为麻风发病危险者，均应密切随访[4]，尤其以6例父/母子关系的接触者为随访重点。

55例正常对照组中，1例PGL-I检测阳性。自述出生于我省麻风流行地区(生活史5年)，家内无明确诊断的麻风患者，应密切随访。

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