以分泌型荧光素酶为报告基因的Nrf2报告系统的建立

张尔婷 江 娜 刘 清 彭丽倩 张倩雯 梁碧华 李润祥 邓蕙研 李华平 朱慧兰

人体皮肤受紫外线(Ultraviolet，UV)照射后产生活性氧族(reactive oxygen species，ROS)，并通过信号传导诱发氧化应激反应，造成皮肤光损失，老化甚至皮肤癌。氧化应激不仅是造成皮肤急性炎症反应如皮肤红斑，水肿等反应的重要因素，同时也是触发多种细胞凋亡的促发因素[1]。

在防御氧化应激的机制中，核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)信号通路起着缓解ROS等氧化应激反应的重要作用，同时也是细胞内最重要的抗氧化通路之一。Nrf2在皮肤内能广泛的表达，尤其是在上皮细胞，包括表皮角质细胞中高表达[2]。

目前在与UV诱导疾病的研究中尚无合适的细胞模型，每次急性光损伤实验均需重复UV照射，实验操作不稳定且操作繁琐，导致实验结果难以相互参考。因此建立与检测Nrf2相关活性的灵敏可靠方法，是该领域研究的前提。其中分泌型荧光素酶(Gaussia Luciferase，GL)较萤火虫荧光素酶具有高分泌表达，检测灵敏度高，且无需裂解细胞等优点。本研究的目的构建一个易检测、高灵敏的Nrf2信号通路报告系统。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株和细胞 HaCaT细胞，分泌型荧光素酶载体，大肠杆菌质粒( 购自上海中国科学院细胞研究所)。

1.2 试剂 Secrete-Pair Dual Luminescence Assay Kit(购自Genecopoeai 公司)；lipofec3000脂质体(购自Invitrogen公司)。

1.3 设备 Infinite F200Pro多功能酶标仪(购自Invitrogen公司)。UVA照射仪(上海Sigma公司)，UVA照射仪(上海Sigma公司)，紫外线辐射强度测试仪(上海Sigma公司)。

2 方法

2.1 细胞培养 将HaCaT细胞培养至对数生长期后，取出各铺24板细胞培养板，并加入500 uL不含抗生素的完全培养基。

2.2 核苷酸链序列设计 以mini-ML(gtgttcctgaaggggggctataaaagggggtgggggcgcgttcgtcctcactctcttcc)和mini-CV(gtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggaga)作为基础转录序列，在其上游的EcoRI和XhoI位点之间分别串联1个、2个、4个和8个抗氧化反应元件(Anti-oxidant response element, ARE)，各个不同个串联元件引物序列如表1所示。同时以CMV启动子驱动的碱性磷酸酶(Alkinane Phosphtase, AP)为内参报告。

表1 核苷酸序列设计

2.3 载体的构建和分组 引物进行褪火后，与XhoI+EcoRI酶切的载体连接，随后转化，挑取单克隆进行测序。根据所使用的经测序验证后的质粒分为2组：以mini-ML为基础转录元件，在EcoRI---XhoI之中分别串联了1、2、4、8个ARE元件。以mini-CV为基础转录元件，在EcoRI---XhoI之中分别串联了1、2、4、8个ARE元件。

2.4 转染 HaCaT细胞一个24孔板铺板24 h后， 每孔板加入600 ng质粒进行转染，采用Lipofectamine3000脂质体进行转染，参照Lipofectamine3000说明书[4]，简述如下：lipo3000每孔加入1 uL，p3000加入1.2 uL。同时HaCaT细胞的control 均加入等量的lipo3000和p3000而无质粒。加入SF(10 uM)和tBHQ(20 uM)继续培养24 h。取培养基上清测定。

2.5 mini-ML序列和mini-CV序列基础轻录活性的对比 没有插入ARE元件的ML空载体(mini-ML)和没有插入ARE元件的CV空载体(mini-CV)的分别转染HaCaT细胞后，以DMSO (Vehicle)，SF(10 μM)和tBHQ(20 μM)处理24 h后，取培养基上清测定。

2.6 分段取样 ML-8XARE质粒转染至HaCaT细胞后，予SF(10 uM)和tBHQ(20 uM)处理，分别于0 h，6 h和24 h，3个时相点取50 μL培养基上清冻存于-80℃，用于测定Gluc和AP活性。

2.7 UV照射后测定Gluc活性 ML-8XARE质粒转染到HaCaT细胞后，分别给予20 J/m2的UVA和200 J/m2的进行光照，在光照后的4 h，6 h和24 h的3个时间点取50 μL培养基上清测定Gluc和AP活性，做好标记后立即冻存于-80℃。

2.8 测定Gluc和AP活性 取得培养基上清解冻后，采用TECAN公司Infinite F200Pro多功能酶标仪，按照其化学发光测量办法，测定Gluc和AP活性，每孔做三次平行转染，进行数据收集。通过对ARE转录原件的串联数目、ARE序列，ARE串联间隔序列进行筛选和优化，获得最高灵敏度的ARE序列和串联数目。

2.9 统计学方法 统计筛选得到最合适的ARE元件串联数目。用SPSS18.0和graphpad prism6.0软件进行数据分析和作图，采用单因素方差分析(ANOVA)进行假设检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同ARE元件的重组质粒报告基因载体鉴定的测序结果 对含重组质粒的菌落进行筛选并增菌，碱裂解法提取质粒DNA后，用DNA测序仪试剂盒进行测序。在质粒的EcoRI---XhoI之中分别串联了1个，2个，4个，8个ARE元件，测序的长度顺序结果(蓝色标示区域)与预期结果相一致，见图1～4。

图1 1个ARE元件的测序结果与预期结果一致(从左至右均为3’到5’的序列)图2 2个ARE元件的测序结果与预期结果一致(从左至右均为3’到5’的序列)图3 4个ARE元件的测序结果与预期结果一致(从左至右均为3’到5’的序列)图4 1个ARE的元件测序结果与预期结果一致(从左至右均为3’到5’的序列)

3.2 不同ARE元件数目

3.2.1 以mini-ML序列作为基础转录序列，在其后分别插入1，2，4和8个ARE转录元件，分别转染HaCaT细胞。将没有插入ARE元件的mini-ML空载体的值设为1。如图5所示，当插入ARE元件逐渐增多时，Gluc活性发生了变化，ARE元件逐渐增多时，Gluc的活性越大(P<0.05)，其中ML-8XARE时Gluc的活性最大。

3.2.2 当以CV序列作为基础转录序列，在其后分别插入1，2，4和8个ARE转录元件，分别转染HaCaT细胞后，图6表明了Gluc 活性变化差异倍数，以没有插入ARE元件的ML空载体的值设为1。可见当插入ARE元件逐渐增多时，Gluc活性越大(P<0.05)。说明当ML-8XARE的Gluc活性最大。

3.3 mini-ML和mini-CV基础转录活性的比较 比较不含转录元件时，检测mini-ML和mini-CV对抗氧化剂响应的情况。由图7可见ML-Vehicle对三种抗氧化剂的反应均小于CV-Vehicle(P<0.05)。说明mini-ML序列本身对抗氧化剂响应要远小于mini-CV序列，因此在后续实验中选用mini-ML作为基础转录序列。

3.4 抗氧化剂作用不同时间，Gluc活性情况 比较不同时间点的ML-8ARE对抗氧化剂SF和tBHQ的活性反映情况 。图8表明了Gluc的相对荧光倍数，即活性变化差异倍数。结果显示当选用ML-8ARE时，对SF和tBHQ在处理是作用最强的时间是6 h(P<0.05)。

3.5 UV照射对Gluc活性的影响 转染ML-8ARE质粒的HaCaT细胞，经UVA和UVB照射后，各个时间点Gluc活性不同。图9表明了Gluc活性变化差异倍数。结果显示当以ML-8ARE时，UVA和UVB作用24 h时，Gluc活性最强。UVA和UVB之间差异不明显。

图5 以mini-ML为基础转录序列，不同ARE元件个数对Gluc活性的影响图6 以mini-CV为基础转录序列，不同ARE元件个数对Gluc活性的影响

图7 不含ARE原件时，mini-ML 和mini- CV对抗氧化剂的响应图8 抗氧化剂作用不同时间，Gluc活性情况图9 UV照射Gluc活性的影响

4 讨论

在判断UV辐射是否导致细胞损伤以造成UV致急性光损伤模型的实验中，目前主要通过观察细胞形态学或繁琐的Nrf2核转位等判定手段。在UV导致急性光损伤中没有合适且易检测的分子标记物。本实验希望通过建立Nrf2的报告系统，实现当细胞受到光损失时，胞内产生ROS，激活Nrf2转移到细胞核内与ARE结合，启动Nrf2的报告系统的转录、翻译和分泌到胞外，启动下游基因的转录。希望通过检测Nrf2的报告系统的活性，从而判断Nrf2的激活情况及细胞受到急性光损伤的情况。

目前，关于Nrf2的报告系统的主要有β-半乳糖、萤火虫荧光素酶、绿色荧光蛋白等。β-半乳糖的报告系统翻译过程较复杂，且不能应用于顺势表达和单细胞以上水平的研究。萤火虫荧光素酶、绿色荧光蛋白和Gluc一样，同属荧光蛋白家族，具有无需其它外源因子的参与自有荧光机制;荧光不干扰细胞和组织的正常生长和功能[4]，观察过程选用显微镜等设备即可完成等优点。Gluc检测灵敏度高萤火虫荧光素酶的1000倍以上，在多种哺乳动物细胞中均能高效的分泌表达，具有无需裂解细胞，检测方便快捷，可实现长期活性的监测的优点。因此本实验选用Gluc作为报告基因。

本实验中，为了建立以Gluc为报告基因的Nrf2报告系统，我们选取了8个ARE元件分别插入质粒的EcoRI---XhoI中，并以CMV启动子驱动的AP为内参报告。采用抗氧化剂SF和tBHQ筛选出不同时间(0 h，6 h及24 h)时的荧光强度，结果表明6 h时荧光强度最高。抗氧化剂处理正常细胞，可迅速激活Nrf2通路，并在6 h时达到最高，但随时间的延长，抗氧化剂的活性逐渐降低，此后细胞本身的反馈抑制机制导致Nrf2通路回复到正常水平而下降。当采用不同波长的UV，即UVA和UVB时，荧光强度在24 h时达到最高，主要原因在于当受到紫外照射后，细胞受到应急损伤，有可能发生细胞凋亡，从而启动细胞本身的抗氧化机制。而启动这一抗氧化机制是个相对比较缓慢的过程，因此在24 h时荧光强度最强。综上结果，我们在实际应用该报告系统时，应同时测量6 h和24 h的ML-8ARE的荧光强度以避免细胞2种不同的反应机制对结果造成的影响。

[1] Svobodova A, Walterova D, Vostalova J. Ultraviolet light induced alteration to the skin[J]. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub,2006,150(1):25-38.

[2] Braun S, Hanselmann C, Gassmann MG, et al. Nrf2 transcription factor, a novel target of keratinocyte growth factor action that regulates gene expression and inflammation in the healing skin wound[J]. Mol Cell Biol,2002,22:5492-5505.

[3] Alam J, Cook JL. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription[J]. Anal Biochem,1990,188:245-254.

[4] Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Greenfluorescent protein as a marker for gene expression[J].Science,1994,263:802-805.