强直性脊柱炎患者外周血T淋巴细胞亚群及NKT细胞的表达及意义

徐文莉，罗 艺，李 康，廖长征，林燕华，张洪德

(广东省深圳市龙岗中心医院中心实验室 518116)

强直性脊柱炎(AS)是一种主要侵犯中轴关节的全身性、慢性、进行性炎性疾病。以骶髂关节为首发病变部位，病变可累及骶髂关节、脊柱和外周关节，以及眼、心、肺等多器官。起病大多缓慢而隐匿，男性青壮年多见，病情严重可致畸、致残最后导致患者生活不能自理，而且较女性严重。AS在全球的患病率为0.1%～1.4%[1]。AS的病因和发病机制目前尚未完全阐明[2]，大多认为与遗传、感染、免疫因素等有关[3-5]，但目前淋巴细胞免疫功能异常在AS中的研究备受关注[6-9]。研究发现T淋巴细胞亚群在AS发病过程起着重要的作用。自然杀伤性T细胞(NKT) 是一群既有T细胞受体又有NK细胞受体的淋巴细胞亚群，以CD3+CD16+CD56+作为NKT细胞的表面标志物，其生物学作用主要包括免疫调节和细胞毒作用，被激活后可分泌大量的细胞因子包括γ-干扰素(γ-IFN)、白细胞介素(IL)-4、IL-10、IL-13等，发挥免疫调节作用。本研究通过流式细胞术检测AS 患者以及健康人外周血T淋巴细胞亚群及NKT细胞水平，探讨T淋巴细胞亚群及NKT与AS间的关系，为AS的研究提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年7月至2016年7月在本院就诊的AS患者69例作为病例组，其中男35例，女34例，年龄19～53岁。AS诊断符合1984年美国纽约修订标准[10]。人类白细胞抗原B27(HLA-B27)阳性40例，HLA-B27阴性29例。所有患者未接受药物治疗，排除哺乳期、肿瘤病史、近期感染或任何其他慢性炎症疾病患者。另选择同期体检健康者22例作为健康对照组，其中男13例、女9例，年龄18～51岁，排除标准同上。两组受试者性别及年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2仪器与试剂 仪器：FACSCantoⅡ流式细胞仪(美国BD公司)，德国Eppendorf 5702R台式离心机，TYXH-Ⅰ-旋涡混合器(上海豫明仪器有限公司)。试剂：硫氰酸荧光素(FITC)-CD3抗体、藻红蛋白花青苷7(PE-Cy7)-CD4抗体、别藻蓝蛋白花青苷7(APC-Cy7)-CD8抗体、藻红蛋白(PE)-CD16抗体、藻红蛋白(PE)-56抗体、HLA-B27检测试剂盒(HLA-B27Kit)、同型对照抗体IgG1-FITC、IgG1-PE-Cy7、IgG1-APC-Cy7、IgG-PE、流式细胞仪7色校准微球(BD FACS 7-ColorSetup Beads)、红细胞裂解液/溶血素、磷酸盐缓冲液(PBS)均购于美国BD公司。

1.3HLA-B27、淋巴细胞亚群、NKT细胞检测标本制备 采集受试者空腹静脉血1 mL，乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，4 h内完成流式细胞仪检测。HLA-B27：采用BD公司的FACSCantoⅡ流式细胞仪及配套试剂检测HLA-B27，以试剂设定的Mark值为界值，小于Mark值为阴性，反之为阳性。淋巴细胞亚群和NKT细胞标本制备：取50 μL的全血与20 μL的抗体混匀，避光15 min，加450 μL的溶血素混匀，避光15 min，运行FACS Diva 软件，将标本置于上样盘中依次收集标本，同时设空白、同型对照，每例收集2×104个细胞，结果用百分比表示。

2 结 果

2.1AC患者与健康对照组T淋巴细胞亚群及NKT细胞检测结果比较 与健康对照组比较，AS患者CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；CD8+T细胞、NKT细胞表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1和表1。

2.2HLA-27阳性组与阴性组外周血T淋巴细胞亚群及NKT细胞检测结果比较 与HLA-27阴性患者比较，HLA-27阳性患者CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值升高，CD8+T细胞、NKT细胞表达水平降低，但差异均无统计学意义(P>0.05)，见图2和表2。

注：A为健康对照组CD4+、CD8+T细胞表达；B为健康对照组NKT表达；C为病例组CD4+、CD8+T细胞表达；D为病例组NKT表达

图1流式细胞术检测病例组与健康对照组T淋巴细胞亚群及NKT细胞

注：A为HLA-27阳性组CD4+、CD8+T细胞表达；B为HLA-27阳性组NKT表达；C为HLA-27阴性组CD4+、CD8+T细胞表达；D为HLA-27阴性组NKT表达

图2 流式细胞术检测HLA-27阳性组与阴性组 T淋巴细胞亚群及NKT细胞表1 病例组及健康对照组T淋巴细胞亚群及NKT细胞检测结果比较

注：与健康对照组比较，*P<0.05

表2 HLA-27阳性组与阴性组T淋巴细胞亚群及NKT细胞检测结果比较

3 讨 论

AS的发病与HLA-B27分布一致，北方多于南方，多数在青少年晚期和20岁以前发病。迄今AS的确切发病机制尚未研究透彻，但是随着免疫学动物模型的研究与分子生物学技术的发展，发现免疫紊乱在AS发病机制起到重要作用。本研究结果显示，AS患者外周血中CD4+、CD8+T细胞表达水平及CD4+/CD8+高于健康对照组；NKT细胞表达水平低于健康对照组，提示T淋巴细胞及NKT细胞参与了AS疾病的发展。研究表明Th1/Th2细胞比例失衡在AS发病中具有重要作用[11-12]，NKT细胞经激活后可分泌大量的细胞因子，参与对机体的免疫调控作用，可同时分泌Th1/Th2型细胞因子，其中包括IL-4可能影响Th1/Th2细胞免疫平衡。已证实IL-4是调控Th2细胞反应的关键细胞因子，NKT细胞的一个显著特点是受刺激后能够很快产生大量的IL-4，而AS患者特征是NKT细胞数量减少，分泌IL-4能力下降，抑制Th2细胞的发育，从而导致Th1细胞免疫功能增强，引发疾病。此外，NKT细胞可以有效清除凋亡小体，从而抑制自身反应性B细胞的激活，而本研究显示AS患者NKT细胞数量降低，导致B细胞活化，使患者体液免疫反应状态活跃，故引发疾病。

AS患者HLA-B27阴性率小于10%，发病机制可能与HLA-B27阳性不同，其淋巴细胞表达是否存在不同，目前研究较少。本试验从HLA-B27阳性、阴性2个方面研究，结果显示二者之间CD4+、CD8+T细胞表达水平及CD4+/CD8+和NKT细胞表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，提示HLA-B27抗原存在与否对CD4+、CD8+细胞及NKT细胞水平的影响不大。

综上所述，NKT细胞表达水平对AS发生起着重要作用，进一步研究NKT细胞参与AS的发生机制，有可能为AS的诊断与治疗提供依据，并有望成为临床治疗的靶点以及疗效评价指标。

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