抗双链DNA抗体水平和抗体亲和力与SLE患者疾病状态的关系以及对两种方法检测能力的影响*

田 野，张云聪，冯珍如，闫惠平，张 岩，张海萍，李 佩，郑芳芳，聂秋燕，刘 晴，王晓宁，张国军,谭延国△

(1.首都医科大学附属复兴医院检验科 100038；2.北京大学第一医院检验科，北京 100034；3.首都医科大学附属北京佑安医院临床检验中心 100069；4.首都医科大学附属北京天坛医院实验诊断中心 100050)

抗双链DNA(dsDNA)抗体是系统性红斑狼疮(SLE)的特征性血清标志物，该抗体阳性是SLE的临床诊断标准之一，并用于SLE患者病情活动程度、肾脏受累和治疗监测的指标。抗体阳性的健康个体将来发生SLE的风险也较高。笔者先前的研究发现，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光法(IIF)检测抗dsDNA抗体，具有较好的互补性，联合两种方法可以较大程度地提升其在SLE患者中的检出率；在非SLE自身免疫性疾病抗dsDNA抗体阳性的个体中，ELISA单独阳性的比例为66.7%，而SLE患者中这一比例为30.5%[1]。基于上述发现，有必要进一步探讨ELISA和IIF对抗dsDNA抗体检出能力具有较明显差异的深层次原因，以及SLE与非SLE自身免疫性疾病患者血清中抗dsDNA抗体性质的异同。抗dsDNA抗体亲和力与SLE病情关系的相关研究提示造成上述现象深层次原因可能与抗dsDNA抗体的亲和力有关[2-4]。为此，本研究使用ELISA和IIF同时检测SLE和非SLE自身免疫性疾病患者血清抗dsDNA抗体，对ELISA检测为阳性的标本进一步测定其抗体亲和力指数，并评估抗dsDNA抗体水平和抗体亲和力指数与SLE疾病状态以及检测方法间的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 留取2014年5月至2015年6月于北京大学第一医院、首都医科大学附属复兴医院和北京佑安医院就诊患者血清标本共计1 095例。其中SLE患者300例(SLE组),男47例、女253例，平均年龄(37±11)岁；非SLE自身免疫性疾病患者共495例(非SLE疾病组)，包括干燥综合征(SS)100例[男12例、女88例，平均年龄(54±16)岁]，类风湿关节炎(RA)98例[男22例、女76例，平均年龄(55±14)岁]，原发性胆汁性肝硬化(PBC)100例[男9例、女91例，平均年龄(54±12)岁]，小血管炎(SV)100例[男43例、女57例，平均年龄(58±14)岁]，以及包括结缔组织病、克罗恩病、特发性血小板减少性紫癜等在内的97例患者[男39例、女58例，平均年龄(43±12)岁]；300例健康人作为健康对照组，男150例、女150例，平均年龄(34±10)岁。SLE的诊断依据参照1997年美国风湿病协会(ACR)的标准进行。其他自身免疫性疾病的诊断分别按相关指南进行。并对120例SLE患者的疾病活动度进行评分(SLEDAI2000评分标准)。SLEDAI评分≤4分患者被认为处于疾病稳定期，SLEDAI评分>4分则处于疾病活动期。

1.2试剂与仪器 ELISA试剂使用德国欧蒙公司的抗dsDNA-NcX抗体检测试剂盒，IIF试剂选用欧蒙公司的间接免疫荧光检测抗dsDNA抗体试剂盒。全自动酶标仪为爱得康公司ADDCARE500，荧光显微镜为奥林巴斯CX40。

1.3方法 采用未加抗凝剂的普通采血管采集所有研究对象的静脉全血，分离血清后，置于-80 ℃冰箱保存待用。所有标本用ELISA和IIF同时检测抗dsDNA抗体，然后进一步测定ELISA检测为阳性标本的抗体亲和力指数。在保证实验环境和仪器处于最佳状态下，严格按试剂盒要求进行实验操作。抗dsDNA抗体亲和力指数检测方法(尿素变性法)：对ELISA检测抗dsDNA抗体为阳性的标本重新用ELISA进行测定，每个标本设立实验孔和对照孔。加入稀释的血清标本温育后洗板1次，实验孔加入200 μL尿素溶液，对照孔加入200 μL洗液，作用10 min后洗板，以洗脱掉实验孔中的低亲和力抗体。其余检测步骤同抗dsDNA抗体。抗体亲和力指数=A实验孔/A对照孔×100 (A为吸光度)。

1.4统计学处理 采用SPSS19.0进行数据处理。偏态分布数据采用M(P25～P75)描述，使用Spearman相关性分析、直线回归分析。两标本间抗dsDNA抗体水平及抗体亲和力的比较采用两独立样本的秩和检验(Mann-WhitneyU检验)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1抗dsDNA抗体水平及其亲和力指数在不同人群中的分布 健康对照组中未检出抗dsDNA抗体阳性个体。抗dsDNA抗体阳性个体中，SLE组有127例，非SLE疾病组有6例。SLE组抗dsDNA抗体水平明显高于非SLE疾病组，差异有统计学意义(P<0.05)； SLE组抗dsDNA抗体亲和力指数与非SLE疾病组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。300例SLE患者中，有120例进行了SLEDAI评分，明确为活动期的标本96例(其中47例抗dsDNA抗体阳性)，稳定期为24例(其中3例抗dsDNA抗体阳性)。活动期的SLE患者抗dsDNA抗体水平[96.7(12.1～383.9)IU/mL]明显高于稳定期SLE患者的抗dsDNA抗体水平[20.9(0.001～52.6)IU/mL],差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2抗dsDNA抗体水平及抗体亲和力指数与SLE疾病活动度的关系 120例SLE患者(其中50例抗dsDNA抗体阳性)抗dsDNA抗体水平与SLEDAI评分相关系数(r)=0.435，P=0.000，回归方程为Y=10.25+0.012X；对于50例抗dsDNA抗体阳性患者，抗dsDNA抗体亲和力指数与SLEDAI评分呈显著正相关(r=0.326，P=0.02)，回归方程为Y=13.48+0.081X。

表1 两组ELISA检测阳性患者抗dsDNA抗体水平和抗体亲和力指数比较[M(P25～P75)]

注：与非SLE疾病组比较，*P<0.05

2.3ELISA和IIF对不同亲和力抗dsDNA抗体的检测能力 133例ELISA检测抗dsDNA抗体为阳性的标本中，IIF也呈阳性的为77例(ELISA和IIF均阳性组)，其抗体亲和力指数为33.1(23.5～52.7)；IIF阴性为56例(ELISA单阳性组)，其抗体亲和力指数为22.1(13.6～48.1)。ELISA和IIF均呈阳性组抗dsDNA抗体亲和力指数明显高于ELISA单阳性组，差异有统计学意义(P=0.024)。就抗dsDNA抗体水平而言，ELISA和IIF均阳性组为355.6(236.1～547.1)IU/mL,明显高于ELISA单阳性组的196.2(148.9～300.6)IU/mL，差异有统计学意义(P=0.000)。

3 讨 论

在SLE患者体内，作为抗原物质的抗dsDNA诱导并活化B淋巴细胞，进而合成致病性抗dsDNA抗体。该抗体与疾病的关系已被广泛研究[3-5]。检测抗dsDNA抗体最常用的方法是ELISA和IIF，由于ELISA可以定量检测抗dsDNA抗体水平，便于观察治疗效果，故而被广泛使用。测定抗dsDNA抗体亲和力的方法有放射免疫方法、色谱技术及ELISA等，但以ELISA最常用。本研究在ELISA的基础上，采用尿素变性技术构建而成[6]。笔者先前的研究显示，抗dsDNA抗体在SLE人群中的检出率(ELISA：42.3%，IIF：38%)明显高于非SLE疾病组(ELISA：1.2%，IFF：0.8%)和健康对照组(ELISA：0.0%，IIF：0.0%)[1]。本研究进一步分析了抗dsDNA抗体阳性的标本，其抗体水平和亲和力指数在不同人群中的分布状况。

本研究在抗dsDNA抗体阳性的患者中，SLE组抗dsDNA抗体水平明显高于非SLE疾病组，同时SLE疾病活动期抗dsDNA抗体水平也明显高于稳定期患者。抗dsDNA抗体水平增高则疾病活动程度(SLEDAI评分)有增加趋势，这点与先前的研究结果相符[7]。以上结果进一步验证了抗dsDNA抗体参与了SLE的病理生理过程，以及与SLE患者疾病活动性的紧密关系。

本研究抗dsDNA抗体亲和力指数SLE组为32.3(19.2～50.7)，与非SLE疾病组的15.5(9.5～49.8)相比，虽然差异无统计学意义(P>0.05)，还是可以明显看出前者高于后者的趋势。之所以差异无统计学意义，可能是非SLE疾病组抗dsDNA阳性例数过少所致(6例)。另外，由于处于稳定期的24例SLE患者中，只有3例抗dsDNA抗体阳性，故未就活动期以及稳定期SLE患者抗dsDNA抗体的亲和力进行进一步比较。上述两部分内容需要增加样本量后进一步研究。

本研究显示，抗dsDNA抗体亲和力指数越高， SLE患者疾病越活跃；而且随着抗体水平的增高，抗dsDNA抗体亲和力也逐渐趋于成熟，这也验证了SUH-LAILAM等[4]的结果。故临床工作中，在对抗dsDNA抗体进行定性和定量检测的同时，测定抗dsDNA抗体的亲和力指数也能从另一个侧面反映疾病的严重程度。

ELISA与IIF两种方法检测抗dsDNA抗体结果出现差异的原因可能是因为包被抗原的种类、来源及流程存在差别所致，导致对不同亲和力的抗dsDNA抗体的检出能力不同[8-9]。本研究进一步证实，ELISA和IIF均阳性的标本，其抗dsDNA抗体亲和力指数明显高于单独ELISA阳性标本。这与之前缺乏证据支持的IIF检测抗dsDNA抗体所针对的亲和力谱位于中、高亲和力的观点相符。也就是说，某些ELISA检测抗dsDNA抗体单独阳性的SLE及非SLE自身免疫性疾病患者是因为体内抗体水平较低且为低亲和力抗体所致。但对于非SLE个体，随着抗体水平的增加和抗体亲和力成熟，其致病性逐渐增强，有机会发展为SLE，这可能是抗dsDNA抗体阳性的个体将来发展为SLE的根源所在。

总之，尿素变性法检测抗dsDNA抗体亲和力指数切实可行。随着抗dsDNA抗体水平和抗体亲和力指数的增加，SLE患者疾病有变得活跃和趋于恶化的倾向。IIF和ELISA对抗dsDNA抗体亲和力谱具有不同的识别能力。

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