白僵菌菌种的分离试验研究

冯玉元

（玉溪市红塔山自然保护区管护局，云南 玉溪 653100）

白僵菌（Beauveria bassiana）属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丝孢科、白僵菌属，可寄生于昆虫纲15目149科521属707种[1]。白僵菌的孢子与虫体接触后，在适宜温度和湿度条件下，吸取水分膨胀萌发1～2根芽管，分泌溶几丁质酶，溶解昆虫体表层几丁质进入虫体内，芽管生长成菌丝后，吸取虫体内水分和养分继续生长，最后虫体充满菌丝而死亡，且死亡后的虫体僵硬并发白。菌丝发育成分生孢子梗，穿过虫体，产生分生孢子，向外飞扬，随风传播，感染其它昆虫，形成昆虫流行病[2]。昆虫被白僵菌吸取水分和养分致使生理代谢障碍、混乱而死亡，对人畜无毒无害无副作用，不污染环境。但在生产白僵菌过程中，菌种在培养基上多次人工转接，易发生衰退和老化，导致产品质量低，影响防治效果。故本试验采用4种方法分离白僵菌的菌种，以期筛选出可一次性获得污染率低、成功率高、质量好、数量多的白僵菌纯菌种。

1 试验材料及器材

试验材料 7月到云南省玉溪市灵照山林间，采集白僵菌感染的思茅松毛虫幼虫的新鲜虫体若干头，作为白僵菌菌种的分离培养种源。

试验器材 解剖刀、96%浓度酒精、升汞液、酒精灯、滴管、接种针、电子天平（精确到0.001g）、显微镜(15×40 倍)、高温高压灭菌锅（126℃0.14MPa、一次可灭菌15 mm×150 mm试管4 000支）、无菌接种箱、试管15 mm×150 mm、培养皿100 mm、三角瓶250 mL、吸管、蛋白胨、葡萄糖、面粉、黄豆粉、普钙、思茅松毛虫幼虫粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、温度计、电磁炉、锅、空调、四川长征药业公司国药准字H51023730硫酸链霉素注射液2 mL、0.5 g。

2 试验方法

2.1 培养基的配制

选用本单位白僵菌生产车间多年实践、生长优良的培养基配方：蛋白胨10g，葡萄糖10g，面粉5g，黄豆粉5 g，普钙1 g，思茅松毛虫粉5 g，磷酸二氢钾 0.2 g，硫酸镁 0.2 g，琼脂 20 g，水 1 000 mL。搅匀，熬化，分装试管容量的三分之一，加盖竖放，分装培养皿2 mm厚，加盖平放。试管成捆包扎，培养皿层叠包扎，250 mL三角瓶装100 mL蒸馏水加盖，置于灭菌锅中，126℃和0.14 MPa灭菌30 min，移至无菌接种箱内，摆斜面长2/3试管，平放培养皿，紫外线消毒30 min，制成无菌斜面和平面培养基及无菌水。

2.2 菌种的分离方法

采用4种方法分离白僵菌的菌种，每种方法采用同一林间白僵菌感染的思茅松毛虫幼虫新鲜虫体中部，统一使用上述培养基配方。4种方法分别接种培养皿平面100个，培养出菌丝后，将菌丝分离接种到试管的整个斜面，每种方法接种1 000支，其中500支加入1%链霉素液接种培养，二者进行污染率对比。

酒精火焰消毒白僵菌感染的虫体分离菌种（方法1） 选取虫体中部，在无菌接种箱内，将其浸入96%乙醇中至湿润，取出后，在酒精火焰上烧一下，用无菌刀解剖虫体成小块（大小1 mm为宜），取1小块置于培养皿中部，20℃培养3天后，可见白色菌丝生长，5天后挑取洁白粗壮菌丝，转接到试管整个斜面，培养10～15天，斜面长满白色粉层即可作为菌种。

升汞液消毒白僵菌感染的虫体分离菌种（方法2） 选取虫体中部，在无菌接种箱内，将其浸入70%乙醇中至湿润，取出后，再浸入0.1%升汞液中2 min，无菌水中清洗，解剖成小块（大小1 mm为宜），取1块置于培养皿中部，20℃培养3天后，可见白色菌丝生长，5天后挑取洁白粗壮菌丝，转接到试管整个斜面，培养10～15天，斜面长满白色粉层即可作为菌种。

不消毒白僵菌感染的虫体用孢子粉划线分离菌种（方法3） 选取虫体中部，在无菌接种箱内，用无菌接种针沾取少量虫体中部白僵菌孢子粉，在培养皿培养基上划线，20℃培养3天后，可见白色菌丝生长，5天后挑取洁白粗壮菌丝，转接到试管整个斜面，培养10～15天，斜面长满白色粉层即可作为菌种。

不消毒白僵菌感染的虫体用孢子粉稀释分离菌种（方法4） 选取虫体中部，用无菌接种针沾取少量虫体中部的白僵菌孢子粉，于100 mL无菌水中摇晃稀释，制成虫体浸泡液，并在培养皿培养基上滴入若干滴，倾斜并旋转培养皿，使浸泡液均匀分布在平面，20℃培养3天后，生长出白色小圆点，5天生长成圆形菌落，当直径为5～10 mm时，挑取洁白粗壮菌丝，转接到试管整个斜面，培养10～15天，斜面长满白色粉层即可作为菌种。

2.3 链霉素对分离白僵菌的菌种作用试验

硫酸链霉素注射液与无菌水按比例配制成1%链霉素液，加入3滴链霉素液于试管培养基面上，并使其均匀分布，挑取菌丝转接到整个斜面，作为方法A，未加入链霉素的，作为方法B，进行污染率比较。

2.4 观察与统计

培养皿接种后，每隔24 h观察1次，连续观察5天，记录菌丝每天的生长情况（表1）。挑取培养皿中分离的菌丝，转接到试管培养基斜面后，每隔24 h观察1次，连续观察15天,每天检查试管污染数量，同时移除污染试管，并对污染试管数量进行累计，记录菌种培养污染数量。

3 结果分析

3.1 培养结果分析

由不同方法分离并培养的白僵菌菌丝生长情况（表1）可知：方法1和2的菌丝生长以接种虫体为中心，向四周生长蔓延，形成近圆形团状结构物；方法3的菌丝生长沿划线轨迹，连续、断续或点状生长，形成条状或点状结构物；方法4的菌丝生长以单个或多个圆点向四周扩大生长，生长成单个或多个分散的圆形菌落。每种方法接种100个培养皿，方法1中生长菌丝的有71个、方法2中有96个、方法3有53个、方法4有31个，但是不能确定白僵菌的纯度。

4种方法分离白僵菌的起始种源为同一林间采集的白僵菌感染的思茅松毛虫幼虫，方法1、2、3不具备单个孢子分开独立条件，接种的种源均为微生物群体，接种培养的产物为多个微生物的菌丝混和物。方法4由于水的稀释作用，可以让接种种源孢子在水中分开并独立成为单个孢子，具备单个孢子独立的条件，单个孢子生长成菌丝，形成菌落，无其杂菌，挑取菌丝转接到试管斜面中培养，容易获取到纯菌种。

表1 不同方法分离并培养白僵菌的菌丝生长情况

3.2 分离结果分析

由挑取分离菌种菌丝培养污染数量统计（表2）可知：4种分离方法培养的菌种，杂菌污染率呈现出显著差异。方法4A培养基中加入链霉素液最佳，杂菌污染率为24%，方法4B培养基中未加入链霉素液较好，杂菌污染率为35.2%；培养基中加入链霉素液后，培养菌种出现的污染率低，显著提高了白僵菌的菌种质量和数量。

白僵菌的种源中存在各种微生物，接种后在培养基上争夺养分，竞争生长，对白僵菌生长产生抑制作用，造成污染。污染白僵菌的主要是细菌，色淡黄，呈胶粘状物；其次是真菌，菌丝呈松散丝状物，孢子呈粉状物，还有毛霉、木霉和黑根霉，分生孢子均为黑色，黄曲霉分生孢子为黄色，青霉分生孢子为青色。培养基中加入链霉素液可有效降低细菌污染率，链霉素可抑制细菌生长，促进白僵菌快速生长，使其快速占据培养基，吸取养分和水分，致使细菌失去养分、水分和生长空间，从而有效降低细菌的污染率，显著提高白僵菌的菌种质量和数量。与未加入链霉素比较，可降低杂菌污染率10%以上。

表2 挑取菌丝分离菌种培养污染数量统计

4 讨论

4种方法分离白僵菌的菌种，其中最好的方法是孢子粉稀释分离菌种，其次是孢子粉划线分离菌种，最差是酒精火焰消毒白僵菌感染的虫体分离菌种和升汞液消毒白僵菌感染的虫体分离菌种。孢子粉稀释分离菌种，杂菌污染率为35.2%，可一次性分离到64%左右菌种；在培养基中加入链霉素，杂菌污染率为24%，可显著降低杂菌污染率，一次性分离到76%左右菌种。在培养基中加入链霉素进行孢子粉稀释分离菌种，为分离菌种的最佳方法。孢子粉划线分离菌种，杂菌污染率为81.6%，一次性分离到20%左右菌种；在培养基中加入链霉素，杂菌污染率为71.2%，可显著降低杂菌污染率，一次性分离到30%左右菌种。酒精火焰消毒白僵菌感染的虫体分离菌种和升汞液消毒白僵菌感染的虫体分离菌种，杂菌污染率高，不宜采用。

［1］ 李增智.中国虫生真菌研究与应用［M］.(第一卷)北京：学术期刊出版社,1988,241.

［2］ 陈华癸，樊庆笙.微生物学［M］.北京：农业出版社，1985,275.