反相液相色谱对多肽的分离、纯化与制备

闫凤

摘要：随着现代生物技术的发展，出现了各种多肽类药物，多肽在临床医学中有巨大的应用价值。用反相高效液相色谱（RPLC）对两种化学合成多肽-32肽和21肽进行了分离、纯化和制备，能够提高多肽的纯度。基于此，文章主要对多肽反相液相色谱法的分离、纯化与制备进行了简单的分析与研究。

关键词：多肽；反相液相；分离、纯化、制备

引言

多肽是氨基酸以肽链连接形成的化合物，其多肽在临床医学中有着较高的应用价值。在现代化生物技术的影响下，多肽化学合成技术水平也在不断提升，但是，由于多肽化学合成的产物成分比较复杂，对其混合物进行分离提纯优化就显得格外重要。只有对多肽化学产物进行分离提纯，才能提高多肽产物的纯度，保证多肽的药用价值。

1反相液相色谱法概述

反相液相色谱法是液相色谱分离模式中使用最为广泛的一种，该方法具有柱效高、分离能力强、保留机理清楚等优点，对于生物大分子、蛋白质及酶的分离分析，反相液相色谱正受到越来越多的关注。在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度，取决于它们在固定相和流动相之间的分配系数，组分在固定相上的保留时间越长，固定相与流动相之间的极性差值越大。而流动相为极性，固定相为非极性的液相色谱就是反相液相色谱。

2多肽反相液相色譜实验分析

2.1实验仪器与试剂选择

第一，实验仪器。选用型号为SCL-10AVP液相色谱仪，该色谱仪包括系统控制器、LC-10ATVP色谱泵、进样阀、SPD-M10AVP二极管阵列检测器、CLASS-VP5.33色谱工作站。色谱柱为200×4mmID的不锈钢管，用匀浆法装填德国进口Nucleosil4000-7C18反相色谱填料。KQ-250型超声波清洗器、TLL-C台式冷冻离心机、E-Pure纯水器。

第二，试剂。试剂选择色谱纯乙腈、三氟乙酸（TFA）、32肽、21肽粗品。

2.2实验方法

将合成多肽粗品用含乙腈水溶液溶解后，离心，保留上清液，弃去沉淀。取一定浓度的多肽样品溶液进样至已用流动相A液[水+0.1%TFA（VV%）]平衡过的RPLC色谱上，然后进行线性梯度洗脱直至达到要求的B液浓度[乙腈+0.1%TFA（VV%）]。流动相A、B液需超声脱气后使用。收集各色谱馏分进行检测，再用100%B液洗脱10min，使残余在柱上的物质完全冲洗下来，然后再用相应浓度的A液使柱平衡，以构成一个完整的色谱过程。流速1.0mL/min，32肽的检测波长为215nm，21肽为280nm。

2.3实验结果分析

2.3.1RPLC对合成多肽的分离

以乙腈作为流动相，用RPLC对合成的32肽和21肽的粗品进行分离。图1（a）和（b）分别是32肽和21肽的RPLC色谱分离图。

图1（a）RPLC对合成32肽的色谱分离

（b）RPLC对合成21肽的色谱分离图

从图1对两种多肽的分离结果可看出，二者的组成都比较复杂。由于没有32肽和21肽的标准品进行对照，无法确认32肽和21肽的目标峰，因此必须收集主要的色谱馏分并对各色谱馏分进行定性分析，以便确定目标多肽色谱峰的位置。分别收集各色谱馏分，冷冻干燥处理后用飞行质谱对各色谱馏分的分子量进行测定（质谱图未给出）。结果表明图1（a）中的色谱峰3和图1（b）中色谱峰2的馏分的分子量分别与合成32肽和21肽的分子量完全吻合，表明图1中的色谱峰3、色谱峰2分别是32肽和21肽的目标峰。

2.3.2RPLC对多肽的制备

第一，梯度方式。从图1看出32肽和21肽的组分都较复杂，需要选择合适的色谱条件对其进行最优化分离，这样才能用最少的分离步骤和最短的时间得到合格的产品。由于32肽与杂质组分的性质非常相似，虽然选择不同的梯度方式，用RPLC对32肽的分离效果还是得不到改善。而从图1（b）可看出，只要选择适当的色谱条件，就可使21肽的目标峰（峰2）与杂质峰得到分离，因此对其梯度方式进行了选择。

第二，进样量。由于没有制备型的反相色谱柱，所以我们用分析型的反相色谱柱通过多次收集样品组分制备多肽。只要在保证柱子对样品的基本分离效果的前提下，尽可能多的进样，就可一次制备更多的样品，从而缩短制备时间，故应对进样量进行选择。32肽和21肽的进样量分别为1.0mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg和5.0mg。当进样量大于5.0mg时，分离效果逐渐变差，因此，32肽和21肽制备时的进样量为5.0mg。通过多次分离纯化，对32肽和21肽的目标峰进行了大量的收集，然后将所收集的样品进行冻干，除去水和有机溶剂。

2.3.3纯度分析

用RPLC对32肽和21肽冻干样品的纯度进行分析检测，分离后21肽的纯度为98.6%，达到了产品纯度95%的要求，而32肽的纯度只有80%左右，达不到95%的纯度要求，因此需要对其进行二次纯化和制备。32肽经RPLC分离纯化后，其纯度仅有80%左右，还含有较多杂质，因此需对其进行二次纯化和制备。为了更好地分离纯化32肽，必须对其分离条件再次进行优化。

首先，对其分离梯度模式进行选择，分别选用了5种线性梯度，线性梯度模式分别为：10%→60%B，30min线性；20%→60%B，30min线性；30%→60%B，30min线性；20%→40%B，30min线性；25%→35%B，30min线性。图2给出了3种梯度模式下32肽的RPLC色谱分离图。

图2 不同线性梯度下32肽冻干样品的RPLC色谱分离

从图2可看出，用梯度e可使32肽与杂质进行有效分离，因此选用梯度e对32肽进行二次分离纯化。优化色谱分离条件后，通过对32肽的目标峰进行大量的收集，对32肽进行二次制备。当32肽冻干样品的进样量超过5.0mg时，样品的分离度大大下降，因此进样量选择5.0mg。优化色谱分离条件后，通过对32肽的目标峰进行大量的收集，对32肽进行二次制备。其色谱图如下所示：

图3二次制备的32肽的RPLC色谱分离

收集的样品进行冻干处理，并用RPLC对32肽的纯度进行色谱分析，经计算其纯度达到96.4%。经计算其纯度达到96.4%，通过36次的分离纯化，共制备得到高纯度的32肽100mg。

结束语

总而言之，通过对多肽的制备、分离、纯化的实验可以发现，在多肽制备过程中，其纯度并不能完全达到标准要求，这就需要对其进行二次提纯指标。对此，相关技术人员应注重多肽分离、纯化技术的研究，为多肽的应用奠定坚实的基础。

参考文献：

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