中药脑心同治药理学研究平台构建及丹红注射液脑心同治机制研究

赵筱萍+余韫如+李雪+邵青+王益民+赵涛+赵超+赵步长+王跃飞+王毅

[摘要] 腦心同治理论是基于中医传统理论并结合临床实践发展而来，该文提出了在脑心同治理论基础上，构建中药脑心同治药理学研究平台的思路，包括脑心同治网络建模、药效物质发现、作用机制研究以及脑心同治方药体内过程研究等。该文以脑心同治网络建模为例，采用数据库以及文献搜索收集疾病相关基因，并通过网络构建与模块分析，最终发现心、脑血管疾病相关的关键生物过程包括氧化应激、代谢、炎症等，其中GSK3B，NOTCH1，CDK4等基因占据网络子簇中关键节点。运用该研究平台，获得了丹红注射液主要成分调控的生物分子网络模型，从而发掘其治疗心脑血管疾病的共有靶点与作用途径。其中，GSK3B在网络中与丹红注射液成分相关性最多，且其所在的子簇涉及到的生物功能有细胞氧化应激。根据分析结果，在氧化损伤心肌细胞与神经细胞模型上验证了丹红注射液可显著提高氧化损伤后心肌细胞与神经细胞的存活率，其保护机制与提高GSK3β蛋白磷酸化水平有关，且丹参与红花配伍具有协同效应。以上结果显示，采用网络建模等方法，可研究揭示丹红注射液等脑心同治方药治疗心脑血管疾病的作用机制。该研究提出的中药脑心同治药理学研究平台框架，为综合运用现代科技手段科学揭示“脑心同治”的机制提供了可行途径。

[关键词] 脑心同治； 丹红注射液； 网络药理学； 氧化应激

[Abstract] The Concurrent treatment of the brain and heart （CTBH） theory is proposed based on traditional Chinese medical theory and clinical practice. In this study， a framework for the pharmacological research platform was established to investigate the principles of concurrent treatment of the brain and heart. The platform for CTBH includes several key techniques for network modeling， discovery of active substances， dissecting mechanism of action and investigation of pharmacokinetic property of TCM. Taking network modeling of CTBH as an example， using database search， literature mining， network construction and module analysis， the that network modules closely associated with the pathological progress of cardiovascular and cerebrovascular diseases were identified， while further functional enrichment analysis of these modules indicated that the key biological processes included oxidative stress， metabolism and inflammation. GSK3B， NOTCH1， CDK4 were identified as key nodes in these network modules. The above-mentioned platform was applied to construct component-biomolecules network of Danhong injection for the identification of common targets and pathways. Among them， GSK3B had the highest correlation with the composition of Danhong injection in the network， and the biological function of whose cluster was related to cell oxidative stress. Based upon results of network analysis， validation experiments suggested that Danhong injection significantly improved the survival rate of oxidative injured myocardial cells and nerve cells， and the protective effect was related to the increase of phosphorylated GSK3β protein expression. Moreover， extracts of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma and Carthami Flos exerted the synergisticcytoprotective effect. The results indicated that the mechanism of treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases of Danhong injection could be studied through network modeling and other methods. In summary， the proposed pharmacological platform provided a feasible way for revealing the mechanism of CTBH by using modern scientific methods.endprint

[Key words] Concurrent treatment of the brain and heart； Danhong injection； network pharmacology； oxidative stress

“脑心同治”理论是基于中医异病同治理念和中医整体观并结合临床实践发展而来[1]。中医典籍记载，“心者，君主之宝”；“脑为元神之府”。脏腑阴阳失调，导致心之脉络受损、气血逆乱，出现痰热壅阻、瘀血内阻等证候，临床表现为胸痹、中风[2]。近代中医学家结合医学发展，总结前人经验，提出心脑共主神明，为脑心同治奠定了基础。尽管心脑血管疾病的病因病机较为复杂，但本虚标实是其共有特征，心肾阳气亏虚为本，痰浊、瘀血阻滞为标，均可归为气虚血瘀证。以益气活血、化瘀通络之法可实现脑心同治[3]。现代医学研究表明，心、脑血管疾病主要是血管动脉粥样硬化或血栓形成引发心、脑等器官缺血事件，动脉粥样硬化是导致冠状動脉、脑动脉以及外周动脉疾病的主要病理过程[4]。因此，临床常采用控制血压、调血脂、抗血小板聚集、抗血栓等多种类型药物进行综合防治。尽管心、脑血管疾病具有共同的病理学基础，然而由于其涉及病理环节较为复杂，如何开展中药脑心同治的药理机制研究尚缺乏较完整的方法体系。

丹红注射液是由丹参、红花提取而成，具有活血化瘀、通脉舒络等作用，用于瘀血闭阻所致的胸痹及中风，证见：胸痛，胸闷，心悸，口眼歪斜，言语蹇涩，肢体麻木，活动不利等症；冠心病、心绞痛、心肌梗塞，瘀血型肺心病，缺血性脑病、脑血栓。临床上，丹红注射液对脑梗死、冠心病、心绞痛、心肌梗死的治疗具有显著效果[5-8]。药理学研究表明，丹红注射液具有抑制血小板聚集、抗炎症损伤、保护血管内皮、抗细胞凋亡等多方面药理作用[9]。

本文提出了中药脑心同治药理学研究平台的框架，以丹红注射液为例，运用该平台获得了丹红注射液主要成分调控的生物分子网络，从而发掘其治疗心、脑血管疾病的共有靶点与作用途径。根据网络分析结果，在氧化损伤心肌细胞与神经细胞模型上验证了丹红注射液可提高氧化损伤心肌细胞与神经细胞的存活率，并以实验证实丹红注射液能调控网络中关键节点GSK3β蛋白的表达与磷酸化水平。

1 中药脑心同治药理学研究平台框架

中医治病讲究辨证论治，注重从整体把握病因、病机以及病症的系统变化，以对机体功能状态做出综合判断。脑心同治理论将心、脑血管疾病防治的基础与临床，综合与分析，宏观与微观，实体本体与关系本体链接起来，突出临床、重在实用，体现了脑心同治方药多成分、多靶点调控机体生物分子网络的作用特点。因此，中药脑心同治药理学研究平台着重研究揭示中药作用于心脑血管系统的过程与机制，包括了脑心同治网络构建、药效物质的筛选发现、药效物质对机体的作用机制研究以及机体对药效物质的处置过程，从而阐明脑心同治的科学原理，指导中药临床应用。据此，中药脑心同治药理学研究平台包括脑心同治生物分子网络建模、脑心同治药效物质发现、脑心同治作用机制研究以及体内过程研究等4项关键技术，见图1。

1.1 脑心同治生物分子网络构建技术 网络医学研究可通过网络建模与网络分析等方法来系统认识疾病发生发展过程中机体生物分子网络的变化规律[10]。网络医学的默认假设为网络拓扑结构与节点连接度的变化与疾病进程有关。运用网络医学研究方法，可系统地发现疾病影响的关键生物分子模块以及关键蛋白，从而为疾病预防、治疗、预后以及药物靶点发现提供了新的研究思路。

运用这一国际前沿研究手段，笔者采用网络药理学研究方法，通过数据库搜索和文献挖掘，获得心脑血管疾病相关的基因、蛋白等生物分子信息，并依据蛋白质相互关系可构建出脑心同治相关生物分子网络。通过对该网络进行子簇分析与功能富集，找出与心脑血管疾病发生发展密切相关的网络模块与关键节点。运用于丹红注射液作用机制研究时，获取丹红注射液中主要化学成分调控的关键蛋白，并进一步构建丹红注射液成分-生物分子网络模型。此外，依据网络分析结果，实验验证丹参提取物、红花提取物、丹红注射液对氧化应激损伤的心肌细胞和神经细胞的保护效应。本文后续将详细介绍脑心同治生物分子网络建模与网络分析的研究方法与结果。

1.2 中药脑心同治药效物质发现技术 研究发现脑心同治药效物质，一方面可用现代语言解释中药防治心脑血管疾病的机制，另一方面也为诠释脑心同治理论提供科学依据。由于心、脑血管疾病发生发展影响因素复杂，涉及细胞组织类型众多，因此，需要采用多层次多途径模型来筛选发现药效物质。本研究前期采用模式生物、组织、细胞等多种药理模型，辨识出丹红注射液中丹参酚酸、红花黄酮、有机酸等药效物质[11]。运用转基因斑马鱼血栓模型筛选发现迷迭香酸、对香豆酸等抗血栓活性成分[12]；在炎性刺激神经细胞模型与氧化损伤心肌细胞模型上发现丹参酚酸B等神经保护活性成分以及羟基红花黄色素A等心肌保护活性成分[13]，从而为质控指标的合理选择提供了科学依据。

1.3 脑心同治作用机制研究技术 天津中医药大学朱彦教授等针对心脑血管疾病发生发展中血管效应、血小板功能、氧化应激、炎症反应、血管新生、细胞黏附等多个关键环节，揭示丹红注射液依赖内皮COX/PGI2途径舒张血管；上调缺血组织CXCR4基因表达促进血管新生，增加缺血区域毛细血管密度，恢复血流供应；抑制COX-2表达，减少PGE2合成及IL-6等炎症因子分泌，减轻系统性炎症反应[14]；多靶点调节G蛋白偶联受体实现Ca2+动员和cAMP信号通路的协调抑制作用，抑制血栓形成；拮抗内质网应激损伤造成的神经元凋亡，抑制小胶质细胞激活发挥保护神经元等作用，从而整体性阐明了丹红注射液脑心同治的分子机制与药理作用特点[15-17]。

1.4 脑心同治方药体内过程研究技术 中国科学院上海药物研究所李川研究员课题组围绕丹红注射液中主要活性成分的体内过程开展系统研究，建立了脑心同治方药体内过程研究技术，明确了丹红注射液主要活性成分的体内暴露水平与清除机制，比较了小鼠、大鼠、犬等不同种属的代谢差异，特别是在健康人体监测了丹红注射液中主要活性成分的体内过程[18]，从而全面揭示丹红注射液主要活性成分的体内分布、代谢与清除规律，为指导临床合理用药提供了依据。endprint

2 脑心同治生物分子网络研究

2.1 数据来源及网络建模方法 本研究所选择的生物分子信息来源于数据库与文献，其中心血管疾病的相关基因来自CHD@ZJU V2.0[19]，并进行去重修改、基因名与基因ID校对。脑血管疾病的相关基因来自DisGeNET[20]，SIDD[21]，MALACards[22-23]，Diseases Database（http：//diseases.jensenlab.org/Search），Disease and Gene Annotations （DGA）[24]等数据库，以“brain ischemia”，“brain infarction”，“stroke”等10个关键词搜索后获得。文献来源的生物分子信息来源于PubMed数据库，以“brain ischemia”等6个关键词检索出文献，并经Pubtator[25]整理获得相关基因，将数据库与文献信息整合為脑血管疾病相关基因。

将上述得到的心、脑血管疾病相关基因进行比对后得到共有基因列表，将其输入到string V10.0[26]（http：//string-db.org/）中获得相对应的蛋白以及整合后的蛋白-蛋白相互作用（PPI）关系，获得共有基因间的相关关系，并采用Cytoscape v3.2.1[27]软件构建网络模型。为了进一步分析网络中排名靠前的功能模块，采用Cytoscape中的插件MCODE[28]获得该网络的子簇，并对每个子簇进行GO分析[29]（http：//geneontology.org/），选取P最小的第一级GO注释以描述其涉及的生物功能。

2.2 心、脑血管疾病共有生物分子网络模型 本研究得到心血管疾病相关基因有1 059个，脑血管疾病相关基因有989个。心、脑血管疾病共有相关基因492个。将该492个基因对应的蛋白以及PPI关系提取出来，筛选出combined score≥0.95的PPI对，共计1 382对。通过Cytoscape软件建立生物分子网络模型后进行子簇分析，得到12个子簇（cluster），将节点数大于3的子簇可视化，见图2。这些子簇中生物分子所涉及的主要生物功能包括生殖发育、Cdc42蛋白信号转导、细胞增殖、细胞氧化应激、环氧合酶途径等，见表1，提示心、脑血管疾病发生发展进程与炎症、氧化应激、凋亡、代谢等密切相关。进一步对子簇中的关键节点按聚类系数以及连接度排序，结果见表2。排名前10的基因包括GSK3B，NOTCH1，CDK4，IL6，E2F1，CDKN2A，PTEN，MAPK3，CDKN1B，RAC1等。其中网络中连接度最高的节点为子簇4中的GSK3B基因，提示GSK3B相对应的蛋白在心脑血管疾病发生发展中具有重要作用。

3 丹红注射液脑心同治生物分子网络研究

3.1 丹红注射液主要化学成分-生物分子网络模型 依据已知丹红注射液主要成分研究的结果[11， 30]，其主要有8种成分：丹参素（DSS）、丹酚酸A（SAA）、丹酚酸B（SAB）、迷迭 香酸（RA）、原儿茶醛（PA）、羟基红花黄色素A（HSYA）、紫丁香苷（syringin）、p-香豆酸（PCA）。在GoPubMed[31]中对丹红注射液主要化学成分相关联的蛋白相互作用网络映射到子簇上，建立丹红注射液主要化学成分-生物分子网络模型，分析丹红注射液对各个子簇的影响。

在所获得的12个子簇中，成分相关基因有30个，根据每个基因与成分的连接数对基因节点大小进行排序，见图3。丹红注射液成分与子簇1、3、4、6、7有关联。其中，丹红注射液成分与子簇1和子簇4关联最多，与子簇1和子簇4关联的节点数≥3的丹红注射液成分有丹参素、丹参酚酸B、羟基红花黄色素等。子簇1功能主要与生殖发育相关；子簇4主要与细胞氧化应激相关。在所有子簇节点中，GSK3B、NFKB1所连接的丹红注射液成分最多。鉴于共有网络子簇中，GSK3B与其他基因连接度最高，说明GSK3B在该网络结构中占据重要位置，提示丹红注射液可能作用于GSK3B调控细胞氧化应激相关通路。

3.2 丹红注射液对H2O2损伤H9c2，PC12细胞的保护作用研究 根据网络分析结果，在过氧化氢损伤的H9c2心肌细胞以及PC12神经细胞模型上验证丹红注射液的抗氧化应激活性。验证实验设置对照组（control）、模型组（300 mmol·L-1H2O2，损伤1.5 h）、丹红注射液组（10 mL·L-1）、丹参提取物组（10 mL·L-1）以及红花提取物组（10 mL·L-1）。模型组加入含300 mmol·L-1的H2O2的培养液，置于细胞培养箱中孵育1.5 h。给药组在给药24 h后，按照模型组的方法进行处理。对照组细胞继续用含10% FBS的高糖DMEM或1640培养液，培养于细胞培养箱。采用MTT法测定细胞活力，Western blot法检测氧化应激相关蛋白表达。

结果显示，与模型组存活率降低至65.80%相比，10 mL·L-1的红花提取物、丹参提取物以及丹红注射液预保护24 h可使氧化损伤后的心肌细胞存活率提高至82.30%，96.61%，118.67%，见图4a，表明丹红注射液具有显著的抗氧化损伤活性，且丹参提取物与红花提取物存在协同效应。

与之类似，丹参提取物、丹红注射液也能显著提高氧化损伤的神经细胞存活率，见图4b。上述结果表明，抗氧化应激是丹红注射液脑心同治的机制之一。

采用Western blot方法检测网络中关键节点GSK3β的表达及磷酸化水平，结果见图5。双氧水损伤使H9c2心肌细胞p-GSK3β/G-SK3β明显降低，而丹红注射液能够显著提高p-GSK3β/G-SK3β水平，且其活性优于丹参提取物与红花提取物。在氧化损伤的神经细胞模型上，也发现丹红注射液在一定程度上能恢复p-GSK3β/G-SK3β水平。该验证结果证实了网络建模与网络分析的结果，即丹红注射液通过调控GSK3B相关生物分子，产生抗细胞氧化应激活性，从而实现脑心同治的药理作用。endprint

4 討论

本研究提出了中药脑心同治药理学研究平台的框架，构建了心、脑血管疾病共有相关生物分子网络，并通过分析丹 红注射液主要成分与子簇基因对应的蛋白之间的关联，发现丹红注射液可对网络子簇1与子簇4的生物分子进行调控，且丹红注射液中不同化学结构类型成分可调控多个网络模块中的生物分子，这表明了不同成分之间多靶点协同作用，出现多成分-多靶点作用的效应。

网络分析发现，丹红注射液主要对细胞增殖、细胞凋亡、发育、免疫、氧化应激、细胞迁移等方面进行调控。并推测出丹参素主要对细胞增殖、凋亡以及细胞迁移等进行影响，而丹酚酸B和迷迭香酸主要对细胞凋亡、发育、氧化应激等进行调控，羟基红花黄色素A主要作用于氧化应激等生物过程。根据2张网络的对比，推测GSK3β可能是在疾病发生发展过程以及丹红注射液治疗中比较关键的蛋白之一，并对此进行了初步的实验验证，与目前的文献报道基本相符合[32-35]。GSK3β促进胚胎干细胞分化成心肌细胞，并可维持心肌细胞的增殖调节，失去对GSK3β的控制可导致机体死亡[35]。持续抑制GSK3β引起心肌代偿性肥大，抑制凋亡和纤维化，并增加心肌收缩力[34]。同时，GSK3β参与代谢紊乱和脑缺血损伤的调节[32]。D′Angelo等报道，磷酸化的GSK3β与脑缺氧缺血的神经保护密切相关[33]。Kim等[34]曾报道，双氧水对H9c2心肌细胞损伤后，减少了GSK3β的磷酸化。Nair等[36]也曾报道，双氧水诱导的氧化应激损伤会引起GSK3β的去磷酸化。在氧化应激损伤下，对GSK3β磷酸化进行恢复，可能在“脑心同治”中具有重要意义。

除了丹红注射液，脑心通、复方丹参滴丸等中成药也常被用于治疗心脑血管疾病。本文所提出的“脑心同治”药理学研究平台，可用于这类脑心同治方药作用研究，通过网络模块分析，找出不同类型化学成分的作用靶点和主要调控的信号通路以及功能模块，为进一步深入探讨药理作用机制、明确此类中成药的临床定位提供科学依据。

陈迪等[37-38]曾报道基于数据科学的“脑心同治”分子机制研究，采用网络构建和有效化合物信息收集，对比2个疾病相关网络的不同结果进行分析。本文采用了数据挖掘、网络分析与实验验证相结合的方法，在2种不同细胞系上验证了丹红注射液对氧化损伤心肌细胞与神经细胞的保护作用。其中，丹红注射液抗氧化损伤机制与GSK3β蛋白磷酸化的关系为首次发现。本文通过网络分析得到GSK3β在丹红注射液治疗心、脑血管疾病中可能起到关键作用，为丹红注射液“脑心同治”作用机制的研究提供科学依据。

氧化应激反映了机体活性氧的产生与抗氧化能力的失衡。活性氧包括超氧阴离子自由基（O2-）、羟基（-OH）、过氧化氢（H2O2）[39]。已有研究表明，氧化应激可导致血管内皮功能障碍，与心、脑血管疾病均密切相关[40-41]。GSK3家族最初被鉴定为糖原合酶的负调节剂，而糖原合酶是糖原合成中的限速酶[42]。实验表明，丹红注射液对GSK3β蛋白磷酸化具有一定影响，可能通过恢复GSK3β的磷酸化以保护心肌细胞与神经细胞在H2O2刺激下的损伤。上述研究表明，丹红注射液可通过抑制GSK3β介导的氧化应激损伤产生心肌细胞与神经细胞保护作用，这对于解释丹红注射液脑心同治的分子机制提供了科学证据。

中药脑心同治药理学研究平台的建立，不仅对于明确脑心同治方药的临床作用特点、指导临床定位和合理用药具有重要意义，同时也为确定质控指标、设计优质中药产品制造工艺提供了科学依据。

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[责任编辑 马超一]endprint