脾气虚证大鼠尿液生物标记物的识别及其生物学意义

刘武平+李婵艺+黄晶+廖婧竹+马文杰+陈宏远+芮雯

[摘要] 考察脾气虚证大鼠尿液小分子代谢组成分，寻找脾气虚证的标记物，阐明其与代谢通路之间的联系。采用劳倦伤脾加限制饮食的方法构建大鼠脾气虚证动物模型，分别进行D-木糖吸收实验及血常规检测。收集的尿液采用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF-MS）分析，尿液代谢指纹图谱数据集进行主成分分析（PCA）和正交偏最小-判别分析（OPLS-DA）等统计学分析，筛选脾气虚证的生物标记物。D-木糖和血常规测定结果表明脾气虚证大鼠造模成功。正、负离子模式下的PCA，OPLS-DA得分图显著区分模型组和空白组。根据OPLS-DA分析的S-plot图、VIP值、t检验及受试者特征曲线ROC下的面积（AUC），筛选并鉴定出苯丙氨酸、琥珀酸、乌头酸、异柠檬酸、甜菜碱、犬尿酸、吲哚、肌酸、肌酸酐、乳清酸、黄嘌呤、黄嘌呤酸等24个脾气虚证相关的生物标记物，主要涉及能量代谢、氨基酸代谢、色氨酸代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢。尿液代谢组学方法结合在线软件包进行数据处理解析代谢通路，可为脾气虚证及其他中医证候的研究提供新的方法和思路。

[关键词] 脾气虚证； 代谢组学； 代谢指纹图谱； 超高效液相色谱-飞行时间质谱联用； 生物标记物

[Abstract] To identify biomarkers for spleen Qi deficiency by analyzing small molecule metabolites in urine， in order to expound the relationship between biomarkers and metabolic pathways. The spleen Qi deficiency model was established through dietary restriction and overstrain. All of the rats received D-xylose absorption experiment and blood routine test. Urine samples were collected in the next day. The urine samples were analyzed using UPLC-Q-TOF-MS to obtain the dataset of urine metabolic group. Principal component analysis （PCA）， orthogonal partialleast squares-discriminant analysis （OPLS-DA） and other multivariate statistical methods were employed to evaluate the quality of the dataset and screen out potential biomarkers of spleen Qi deficiency. The results of D-xylose absorption and blood routine demonstrated that the spleen Qi deficiency model was successfully established. In positive ion mode and negative ion mode， PCA and OPLS-DA score plots could clearly distinguish model group and blank group. According to S-plot of OPLS-DA， VIP value， t-test and area under receiver operating characteristic curve （ROC）， 24 biomarkers， including phenylalanine， succinic acid， aconitic acid， isocitrate acid， betaine， kynurenine， indole， creatine， creatinine， orotic acid， xanthine， and xanthurenic acid， were identified as associated with the spleen Qi deficiency， mainly involving energy metabolism， amino acid metabolism， tryptophan metabolism， purine metabolism and pyrimidine metabolism. Urine metabolomics method combined with online software package for data processing and analysis metabolic pathway can provide new methods and ideas for studies for spleen Qi deficiency and other traditional Chinese medicine symptoms.

[Key words] spleen Qi deficiency； metabolomics； metabolic fingerprint； UPLC-Q-TOF-MS； biomarker

代謝组学是测定生物体受病理生理刺激和基因修饰所产生的与时间相关的多元代谢产物的一门新学科[1]。通过分析生物体液和组织中内源性代谢物，可以寻找代谢物变化与整体生物学状况的关系。近年来，代谢组学发展迅速，已经在植物学、毒理学、临床诊断、药物研发、营养科学等研究领域都得到了广泛的应用[2]。代谢组学技术对于建立中医病症和机制的关系发挥重要的作用。endprint

脾气虚证是临床常见的中医病症之一，是因脾气不足，运化失职所表现的虚弱证候[3]。脾气虚证导致水谷精微运化不良、水液停滞而引起体内各种物质代谢紊乱，出现腹胀食少，大便溏薄，肢体倦怠，神疲乏力，气短懒言，形体消瘦等症状[4]。目前，脾气虚证的诊断多采用血清胃泌素、尿D-木糖排泄率、动物体征等指标，而这些指标难以系统阐述脾气虚证的本质。脾气虚证标记物的研究多为找出差异代谢物，而对于代谢物与脾气虚证的本质的相关性却报导较少。徐荧等[5]应用代谢组学探讨脾气虚大鼠血清小分子的变化，得到了一些与能量代谢相关的脾气虚证的标记物。战丽彬等[6]分析血浆小分子代谢组成分，发现了3个脾气虚证代谢综合症的生物标记物。尿液是代谢组学研究重要的样本之一，其含有多种内源性的小分子代谢物，能够很好的反应机体的变化。尿液具有非损伤性、样品量大优点，且尿液中蛋白含量低，前处理简单。相比血清，尿液中共轭化合物的数量高于血清[7]。因此，本实验从尿液代谢物入手，采用UPLC-Q-TOF-MS技术进行尿液代谢组学分析，通过R语言相关包进行多元统计分析筛选脾气虚证标记物，并寻找与脾气虚证相关的代谢通路，阐明代谢标记物与脾气虚本质的联系。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 UPLC-Q-TOF-MS 分析仪（美国Waters公司），Masslynx V4.1软件 （美国Waters公司），FRESCO17低温高速离心机（Thermo公司），紫外分光光度计（美国Beckman公司），DL-360A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司），甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司），甲酸（色譜纯，德国CNW科技公司），亮氨酸-脑啡肽对照品（Sigma公司），超纯水（屈臣氏）。

1.2 动物实验和样品收集 雄性SD大鼠22只，体质量（200±20） g，购自广东药科大学动物实验中心，健康证号44005900001668。脾气虚模型的构建按先前的研究方法进行[8]。过程如下：所有动物适应性喂养1周，供试动物分为2组，空白组（K）11只，模型组（M）11只。空白组常规方法饲养，模型组单日游泳加禁食，双日限制饮食（75 g·kg-1）的方式造模15 d，第16天进行大鼠血常规检查和D-木糖吸收实验。血常规检测送于广东药科大学附属第一医院。第17天收集各大鼠的24 h尿液，保存于-80 ℃冰箱中备用。

尿液样品室温解冻。200 μL尿液加入300 μL的乙腈，涡旋2 min，4 ℃，13 000 r·min-1离心15 min，吸取上清液加入进样瓶，待UHPLC-MS分析。吸取10 μL的各组尿液混合制成质量控制（QC）样品。

1.3 UPLC-Q-TOF/MS分析样品 色谱条件：色谱柱Acquity UPLCTM HSS T3（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，Waters公司）；预柱为Waters AQUITY UPLC HSS T3 Van Guard Pre-Column（2.1 mm×5 mm，1.8 μm，Waters公司）；进样量5 μL；流速0.3 mL·min-1，柱温25 ℃；进样室温8 ℃，流动相为乙腈（B）和0.1 %甲酸水（A）。梯度洗脱条件：0～3 min，5%～20% B；3～7 min，20% B；7～18 min，20%～50% B；18～19 min，50%～100% B，19～20 min，100% B；20～21 min，100%～5% B；21～23 min，5% B。

质谱条件：采用ESI离子源，在正离子、负离子模式下分别采集数据，数据采集范围m/z 100～1 500。离子源参数：毛细管电压3 kV，锥孔电压30 V，离子源温度100 ℃，脱溶剂温度300 ℃，雾化气（N2）流速50 L·h-1，脱溶剂气（N2）流速 500 L·h-1；碰撞能量（CE）10～40 eV。由于代谢物的浓度比较低，二级质谱的解离电压设为10～20 V，以保证每个离子能够得到碎片离子。Lock Mass为脑啡肽，实时校正的质量数：正离子模式[M+H]+为m/z 556.277 1，负离子模式[M-H]-为 m/z 554.261 5。流速为 0.02 mL·min-1，电喷雾的频率为10 s。所有上诉的参数设置均采用Masslynx软件控制，并进行数据的收集。

进样程序：实验首先进QC样品5次以平衡色谱柱和系统，然后分析样品。每5个样品插入1个QC样品，所有样品随机进样，同批次进行，消除进样次序和批次对分析结果的影响。正、负离子模式均采用上述进样方式。

1.4 数据处理 数据处理所用到的相关软件为：Masslynx软件，MSconvent软件，R语言（3.2.3版本），R相关软件包（xcms[9]，ropls[10]，metabolomics，pROC，pheatmap）。具体过程：液质数据文件（.Raw）通过MSconvent软件转换为（.cdf）文件，转换后的数据通过xcms包进行峰识别，峰匹配，峰校正，峰积分，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的三维数据矩阵。xcms包所用函数分别为xcmsSet，retcor，group，fillPeaks，这些函数的相关参数设定为fwhm=10，bw=10，sn=5，mzrange=100～1 500。用metabolomics包中的Normalise函数对数据矩阵进行归一化，函数参数method设定为sum。ropls包中的opls函数对数据矩阵进行PCA分析和OPLS-DA分析，PCA分析中opls函数的参数设定为scale="center"（中心化处理），其余参数用默认参数；OPLS-DA分析opls函数参数设定为scale="center"、predI=1（预测的主成分个数）、permI=1 000（置换检验次数）、crossvalI=10（十折交叉验证）。十折交叉验证的R2Y和Q2Y和置换检验对OPLS-DA模型进行质量评判。OPLS-DA分析的样品诊断图剔除组内差异大的样本。剔除差异样本后的数据进行OPLS-DA分析，通过OPLS-DA模型中变量的VIP值（VIP>1）、S-plot图（Pcorr [1]>0.1，P[1]>0.05），筛选潜在标记物。metabolomics包中的TwoGroup函数对标记物进行独立样本的t-检验，删除在空白组和模型组没有显著性的标记物（P<0.05）。pROC包中的ROC函数对标记物进行ROC曲线分析[11]，根据曲线下的面积大于0.7筛选具有诊断效果的标记物[12]。endprint

筛选出来的标记物的m/z输入Masslynx软件，计算出可能的加和离子和分子式，匹配HMDB，KEGG，MMCD，METLIN数据库，找出误差<10的代谢物和相关的MS/MS信息。对比二级信息确定最终的代谢物，这些代谢物即为脾气虚证的标记物。Pheatmap包的pheatmap函数对标记物进行热图和聚类分析，评估标记物对模型的分离效果。

2 结果

2.1 脾气虚模型的确定 脾气虚模型的确定可通过动物体征、D-木糖吸收、血常规的白细胞数（WBC），淋巴细胞數（LYMPH），血红蛋白含量（HGB）及体质量变化等方面考察。在体征方面，模型组大鼠出现躬身、扎堆、温顺、便软等现象；模型组大鼠游泳时间随着造模时间降低；正常组无上述体征。血常规、D-木糖吸收及体质量变化见表1。结果显示，模型组与正常组相比，模型组大鼠体质量显著性降低（P<0.01）、D-木糖吸收显著降低（P<0.01）、白细胞数和淋巴细胞数显著下降（P<0.01），血红蛋白含量显著降低（P<0.05），与前期研究结果相符[8]。D-木糖吸收降低表明脾气虚证大鼠存在脾胃功能异常；WBC和LYMPH的下降说明脾气虚证大鼠免疫功能降低。以上结果表明脾气虚模型可用于后续的实验。

2.2 尿液代谢指纹图谱分析 采用UPLC-Q-TOF- MS技术对大鼠尿液进行分离与数据的采集。正、负离子模式下的基峰离子色谱图（BPI），见图1。同一样本的BPI图在正、负离子模式下互补，尿液中的代谢物得到很好的分离，保留时间在23 min内。本方法适用于全面的，完整性的代谢组学分析，有利于获取更多的代谢物信息。

2.3 分析方法考察与数据质量评估 随机挑选6个尿液样本，按1.2项下的尿液处理方法平行处理样品，UPLC-Q-TOF-MS分析，考察分析方法的重现性。QC数据挑选部分m/z，分别计算保留时间和峰面积的RSD，考察分析方法的稳定性，见表2。在正、负离子模式下，稳定性和重复性的保留时间RSD均小于2.0%，峰面积RSD均小于8.0%。表明采用的分析方法稳定性和重复性良好，可用于后续的样品分析。

正负离子模式下的液质数据经峰匹配、归一化、中心化等处理分别得到2 435个变量和1 794个变量。OPLS-DA是一种有监督的分析，组内差异会降低模型的预测能力。对变量进行OPLS-DA分析，基于OPLS-DA模型的样品诊断图，剔除组内的差异样本[13]。由正负离子模式下的样品诊断图可以看出K8至K11和M10，M11不在样本的聚类范围内，故剔除。对空白组、模型组及QC数据进行PCA分析，通过QC数据在PCA得分图中的分布考察数据的可靠性。得分图显示正负离子模式下的QC样品分布集中，表明数据可靠；同时，正负离子模式下，空白组和模型组在第一主成分下能够区分，表明模型可靠，见图2。

2.4 脾气虚证生物标记物的确定 正负离子模式下的数据矩阵进行OPLS-DA分析，并对OPLS-DA模型进行十折交叉验证及置换检验，避免模型的过度拟合，确保模型的可靠性[14]，见图3。

OPLS-DA得分图显示正常组和模型组能显著区分。通常R2Y用来估计所构建模型与Y数据的匹配程度，Q2Y则用来评判所构建模型的预测能力[15]。R2Y和Q2Y的值越接近1，模型预测能力越高。正、负离子OPLS-DA模型的相关参数也列于图3。正、负离子下OPLS-DA模型的R2X均大于0.6，R2Y，Q2Y均大于0.8，结果表明模型具有较高的解释能力和预测能力。正、负离子下经1 000次置换检验获得的R2Y与Q2的值接近真实模型的概率均低于0.001，其大部分小于真实模型计算值[16]。上述结果表明，在正、负离子模式下，样本的多变量数据模型符合参数标准，可应用于候选生物标志物的筛选。基于OPLS-DA模型的VIP大于1和S-plot图（Pcorr[1]>0.1，P[1]>0.05）及独立样本t检验（P<0.05），一共筛选了34个潜在标记物，其中正负离子模式下相同的标记物有5个。标记物经ROC分析，24个标记物在ROC曲线下的面积（AUC）大于0.7，这些标记物即为脾气虚证的标记物。标记物的鉴定主要通过二级碎片信息和数据库 匹配。具体鉴定过程为：如m/z 206.045 2的母离子，根据数据库匹配误差<10的代谢物，推测可能为黄嘌呤酸，在同样的色谱条件下对尿液中的m/z 206.045 2 进行MS/MS分析，得到206.045 2的碎片信息为188.027 0，178.035 6，162.083 5，149.021 8。结合网络数据库，碎片离子188.027 0认为是分子脱去1个H2O分子，178.035 6认为是分子脱去CH2O，162.083 5认为是分子脱去HCOOH，以上3 个碎片能够匹配二级数据库中的碎片信息。而碎片离子149.021 8可能是分子脱去CH3COOH分子和H2O分子后加入NH4+而得到的子离子，因为在二级网络数据库中m/z 206.045 2 存在132.043 9的碎片离子（[M+H]+），131.043 9和149.021 8相差的相对分子质量为18，所以可能为131.043 9分子加和了NH4+。所有标记物的二级信息见表3。

2.5 标记物的热图与聚类分析 将24个标记物的相对色谱峰强度数据导入R软件，经scale转化利用pheatmap包进行HCA聚类分析生成相应的热图，见图4。图中颜色变化可以清晰地看到，24个代谢物中吲哚、胆碱、高丝氨酸、苯丙氨酸、吲哚乳酸、琥珀酸、甜菜碱等11个标记物在模型组中显著的升高，肌酸、肌酸酐、犬尿酸、黄嘌呤、黄嘌呤酸、乳清酸、血清素、柠檬酸等13个标记物显著的降低；样品的聚类结果表明空白样品和模型样品聚类明显，说明这24个标记物能够将模型组和正常组区分。

2.6 脾气虚证生物标记物的生物学意义 24个脾气虚证潜在标记物涉及的代谢通路主要为能量代谢、氨基酸代谢、嘌呤代谢及嘧啶代谢。参考KEGG数据库的代谢通路图，利用Cytoscape软件制作脾气虚证代谢标记物的代谢通路图，见图5。结果表明，色氨酸代谢是脾气虚大鼠改变最为显著的代谢通路，多达9个代谢物与此通路相关。由此可知，脾气虚证出现各种症状与色胺酸代谢紊乱有很大的联系。脾气虚证大鼠通常会有食欲降低和扎堆的症状并且食量下降，推测是受色氨酸代谢的影响。实验结果还表明吲哚、吲哚乳酸、3-甲基羟吲哚在脾气虚模型组中的含量显著的升高，而这些标记物均是色氨酸的代谢产物。其中犬尿酸、黄嘌呤酸、血清素等含量显著的降低，其原因可能是色氨酸的犬尿酸代谢途径和5-羟色胺代谢途径被抑制。有研究表明，色氨酸的犬尿酸代谢途径和5-羟色胺代谢途径受免疫反应的影响，免疫功能的降低会影响吲哚2，3-双加氧酶（IDO）的活性，从而抑制其代谢途径[17]。而色氨酸在色氨酸酶的作用下能够代谢为吲哚等相endprint

关代谢物[18]。有研究显示，脾气虚证大鼠因肠道菌群失调，肠黏膜通透性增加导致免疫能力降低[19]。因此，脾气虚证大鼠尿液中的犬尿酸、黄嘌呤酸、血清素、吲哚乳酸、吲哚等含量的异常提示色氨酸代谢紊乱参与了脾气虚证的病理进程。

乌头酸、柠檬酸、琥珀酸是三羧酸循环中重要的中间产物，而三羧酸循环是糖酵解的主要通路，并且也是机体重要的能量供应渠道。在本研究中，乌头酸，琥珀酸在脾气虚模型组中的含量显著升高，柠檬酸在脾气虚模型组中含量显著降低。这可能与三羧酸循环中的相关酶的活性降低有关或者细胞线粒体功能的失常所致。有研究表明脾气虚证大鼠中的琥珀酸脱氢酶的活性降低，抑制机体的三羧酸循环，导致琥珀酸在体内的积累[20]。研究发现脾气虚患者胃粘膜壁细胞单位面积内线粒体均数明显减少，并出现肿胀、嵴断裂、膜缺损等症状[21]。表明脾气虚证显著抑制了三羧酸循环从而降低了机体的能量供应，导致机体气血生化不足，从而出现精神疲惫、乏力，扎堆等症状。

在甘氨酸和丝氨酸的代谢通路中胆碱、甜菜碱在模型中显著的升高，肌酸和肌酸酐的含量下降。这可能与线粒体功能异常及肌球蛋白表达下降有关。胆碱和甜菜将是机体合成甘氨酸的原料，其代 谢主要是在肝和肾的线粒体内进行，仅有4%被吸收的甜菜碱经肾脏排出，脾气虚大鼠尿中甜菜碱的含量升高，说明体内甘氨酸的合成受阻。在大量的运动情况下，肌酸分解形成肌酸酐，为机体提供能量。周昕欣等[22]在补中益气汤治疗脾气虚证大鼠肌无力的机制研究中发现脾气虚组大鼠磷酸化肌球蛋白轻链的表达显著下降，导致肌肉收缩能力下降，出现大鼠肌无力。本研究发现脾气虚证游泳时间下降，由此说明丝氨酸和甘氨酸相关代谢物可以作为脾气虚证的标记物。本研究还发现，苯丙氨酸含量异常说明脾气虚证显著的影响了苯丙氨酸代谢。在脾气虚模型中，当苯丙氨酸代谢部分被阻断后，苯丙氨酸含量在尿中排出量可能会增加。相关文献报导了脾气虚证血清也有苯丙氨酸代谢物[23]。由此推测脾气虚证可能涉及苯丙氨酸代谢途径的异常。本实验还筛选出了其他代谢通路（如牛磺酸代谢，嘌呤代谢、嘧啶代谢），这3个代谢通路是本次研究首次提及的，与脾气虚证的关系仍需进一步的探究。

3 讨论

本实验共筛选鉴定出苯丙氨酸、琥珀酸、乌头酸、柠檬酸、甜菜碱、犬尿酸、吲哚、肌酸、肌酸酐、乳清酸、黄嘌呤、黄嘌呤酸、胆碱等24个脾气虚证大鼠生物标记物；涉及的相关代谢通路主要为能量代谢，氨基酸代谢，嘌呤代谢和嘧啶代谢等。尿液代谢组学研究方法结合在线软件包数据处理解析代谢通路，可以为脾气虚证及其他中医证候的研究提供新的方法和思路。

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[责任编辑 张燕]endprint