基于UPLC的独一味中8种成分测定及其含量影响因素初步研究

2018-01-29苟燕梅钟世红古锐赵灿杨春生

中国中药杂志 2017年24期

苟燕梅+钟世红+古锐+赵灿+杨春生

[摘要] 建立同时测定独一味中胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷和麦角甾苷8种成分含量的方法。采用Kinetex XB-C18色谱柱（4.6 mm×50 mm，2.6 μm）以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～10 min，6%～14.5% A；10～18.5 min，14.5%～17% A；18.5～23 min，17%～18% A），流速1.0 mL·min-1，检测波长238，320，350 nm，柱温30 ℃。结果发现8个成分分离度良好，在线性范围内呈现良好的线性关系（r≥0.999 8），平均加样回收率96.61%～100.4%。该方法操作简便，专属性好，精密度高，可用于独一味药材的鉴别及质量评价。研究表明，独一味各类成分之间具有相关性；产地是影响独一味成分含量的主要因素；退化梯度对其含量影响不明显；样品储藏一年后胡麻属苷含量显著降低。

[关键词] 独一味；超高效液相色谱；含量测定；环烯醚萜苷；苯乙醇苷

[Abstract] To establish a method for simultaneous determination of the contents of sesamoside， menthyl chloride， chlorogenic acid， caffeic acid， 8-O-acetyl-phloridzin methyl ester， forsythiaside B， luteolin， and ergosterol， the LIPLC analysis was performed on a Kinetex XB-C18 （4.6 mm×50 mm，2.6 μm）column with acetonitrile （A）-0.1% phosphoric acid solution （B） as the mobile phase. The flow rate is 1.0 mL min-1. The detection wavelength was 238， 320 and 350 nm and column temperature was 30 ℃. The results showed that the eight components could be completely separated with good linear relationships （r ≥ 0.999 8） in the linear range. The average recoveries were 96.61% -100.4%. The method was simple with strong specificity and high precision. It can be used for the identification and quality evaluation of the Lamiophlomis rotate.The results also showed that there was a correlation between the various components， and the habitat was the main factor affecting the content of the eight components. However， the degradation gradient had no obvious effect on the contents， while the content of sesamoside was significantly decreased after one year of storage.

[Key words] Lamiophlomis rotate； UPLC； contents determination； iridoid glycosides； phenethyl alcohol glycoside

獨一味Lamiophlomis rotata （Benth.）Kudo为唇形科独一味属植物，藏语称“大巴”、“打布巴”，主要分布于我国中西部地区如西藏、青海、甘肃和四川等地，海拔2 700～4 500 m的高原或高山上强度风化的碎石滩中或石质高山草甸、河滩地。独一味为藏族、蒙古族、纳西族等少数民族常用草药，具有活血止血，祛风止痛之功效，用于跌打损伤，外伤出血，风湿痹痛，黄水病等[1]。近年来独一味显著的镇痛作用备受关注[2-3]，现有胶囊和分散片等多种产品，广泛用于各种疼痛、出血证的治疗，且长期给药不产生耐受性。持续过度采摘使得独一味野生资源蕴藏量急剧下降，被列为一级濒危藏药品种[4]，《中国药典》自2010年版起将独一味的药用部位由根茎更改为地上部分，以保护该野生资源的可持续利用。

独一味中含有多种有效成分，主要有环烯醚萜苷、苯乙醇苷和黄酮类等三大类成分，苯乙醇苷类具有一定的镇痛活性[5]，黄酮类具有一定的抗炎活性[6]，环烯醚萜类为主要镇痛、抗炎、止血的有效成分[7]。独一味的质量评价多采用HPLC测定其中的1～2类成分，同时测定的成分数目有限且耗时偏长[8-9]。为了缩短分离时间，提高分离效率，本试验采用UPLC（ultra performance liquid chromatography）同时测定独一味中胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷和麦角甾苷共8种成分，涵盖多类指标成分，包括了3种环烯醚萜苷、2种苯乙醇苷、1种黄酮及2种咖啡酰，且专属性好，精密度高。对不同产地，不同草地退化等级及贮存时间对独一味成分含量的影响进行了初步分析。本研究可为独一味药材的鉴别、质量评价及可持续利用提供科学依据。endprint

1 材料

Prominence UFLC XR超快速液相色谱仪（日本岛津）、BSA124S电子天平（德国赛多利斯）、UPH-I-10T型超纯水器、Kinetex XB-C18色谱柱（4.6 mm×50 mm，2.6 μm）。胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷、麦角甾苷对照品均来自成都曼斯特生物科技有限公司，乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。独一味32批，2015年7—8月自采或购买，经成都医学院钟世红教授鉴定为独一味L. rotata的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kinetex XB-C18色谱柱（4.6 mm×50 mm，2.6 μm），流动相乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，6%～14.5% A；10～18.5 min，14.5%～17% A；18.5～23 min，17%～18% A）；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量2 μL。胡麻属苷、山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯检测波长为238 nm，绿原酸、咖啡酸、连翘酯苷B、麦角甾苷检测波长为320 nm，木犀草苷检测波长为350 nm。上述色谱条件下，样品各色谱峰保留时间适中，样品中各组分的色谱峰分离度良好，对照品及样品图见图1。

2.2 对照品溶液制备称取减压干燥至恒重的对照品适量，加入甲醇配制成每1 mL含胡麻属苷0.275 mg、山栀苷甲酯0.278 mg、绿原酸0.494 mg、咖啡酸0.036 mg、8-O-乙酰山栀苷甲酯0.328 mg、连翘酯苷B 0.448 mg、木犀草苷0.422 mg、麦角甾苷0.334 mg的混合对照品A溶液。精密吸取混合对照品A 1.0 mL，置10 mL量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，作为稀释后的混合对照品B溶液。

2.3 供试品溶液制备取独一味粉末（中粉）约0.5 g，精密称定，加入70%甲醇30 mL，精密称定，回流提取60 min，冷却后补足失重，摇匀，静置，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察分别吸取2.2项混合对照品B溶液1，2，4 μL，混合对照品A溶液4，8 μL，进样分析。以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到各对照品的回归方程、相关系数和线性范围，结果见表1。

2.5 精密度试验取同一供试品（S4）2 μL，重复进样5次，计算得胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷、麦角甾苷峰面积RSD分别是0.28%，0.50%，1.2%，0.50%，0.53%，0.21%，1.4%，0.16%。表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验取同一供试品（S4）粉末6份，分别按2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件测定。结果胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷、麦角甾苷峰面积RSD分别是0.49%，0.33%，1.6%，0.73%，0.64%，0.58%，0.98%，0.75%。表明方法的重复性良好。

2.7 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液（S4），分别于0，1，2，4，6，12，24 h时进样测定，记录峰面积。结果胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷、麦角甾苷峰面积RSD分别是0.69%，0.66%，1.4%，1.2%，0.81%，0.55%，1.1%，0.46%。表明独一味供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验取同一供试品6份，每份约0.25g，精密称定，分别精密加入70%甲醇溶液配制的各对照品溶液适量，按2.3项方法制备供试溶液并依法测定，计算加样回收率，结果见表2。

2.9 样品的测定参考草地退化的分级标准[10]，根据植物群落结构、土壤裸露程度将所调查独一味样地退化程度分为4级，分别为：极度退化草地、重度退化草地、中度退化草地、轻度退化草地。取独一味样品，按2.3项方法分别制备供试品溶液，平行2份，吸取供试品溶液2 μL，按 2.1 项色谱条件测定。计算样品含量，结果见表3。

3 结果和讨论

3.1 8种成分相关性分析采用了SPSS 21.0软件对8种成分的相关性进行了分析，结果见表4。

分析结果表明，咖啡酸、绿原酸、连翘酯苷B、麦角甾苷、木犀草苷、胡麻属苷之间体现出良好的正相关。其中前5种成分在其结构中均含有对羟基桂皮酸母核，这类成分均为莽草酸合成途径，说明这些成分受到的调控是一致的。

山栀苷甲酯与8-O-乙酰山栀苷甲酯含量呈显著负相关，二者同为环烯醚萜类，前者环烯醚萜母核8位上乙酰化即得后者，二者含量呈此消彼长。

3.2 聚类分析与主成分分析以独一味8种成分含量为指标，采用SPSS 21.0软件对不同地区32批独一味进行相似性分析、聚类分析和主成分分析，其中，第一主成分主要反映了绿原酸、连翘酯苷B、咖啡酸、木犀草苷、麦角甾苷的信息，第二主成分主要反映了山栀苷甲酯的信息，见图2。

结果显示，独一味中8种成分含量体现出一定产地特征。即相同产地或地理位置接近的样品多聚成一类或主成分投影较为接近。如阿坝县、久治县样品距离较近且在主成分投影中多投影在聚类图的右侧，玛曲县样品聚集在投影图的左侧，而色达县的样品相对分散。

另一方面，随草地退化程度加剧，各产地8种成分总量变化趋势分别为：四川阿坝县：轻度退化样> 极度草甸样>灌丛退化样>中度退化样；青海久治县：极度退化样>灌丛草甸样>中度退化样>重度退化样；四川色达县：中度退化样>轻度退化样>极度退化样；甘肃玛曲县：轻度退化样>极度退化样>重度退化样>正常草地样。其中，四川阿坝县不同退化梯度含量差异较小，四川色达和甘肃玛曲在不同退化程度草地上的樣品含量差异显著。总体而言，独一味中8种成分含量与所在草地退化等级无相关性。endprint

3.3 不同产地成分含量比较四川省阿坝县、四川省色达县、甘肃省玛曲县、青海省久治县4个产地8种成分总含量的平均值，见表5。结果显示，8种成分总含量以四川省阿坝县样品最高，青海省久治县样品与阿坝县较接近，而甘肃省玛曲县样品含量最低。

3.4 储存时间对8种成分含量的影响分析所有样品均在采集当年的2015年9月及储存1年后的2016年9月分别进行了测定，测定结果显示的是贮存1年前后，所有样品各成分含量总和，见表6。

结果表明，胡麻属苷减少了23%，变化幅度最大，分析认为胡麻属苷结构有环氧乙烷结构，不稳定，极易与亲核试剂发生开环反应，造成含量降低。山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯储存1年以后稍有降低；连翘酯苷B、麦角甾苷储存1年之后含量略有增加；木犀草苷儲存1年后含量变化不明显。

[参考文献]

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[2] 白蓉，郭延伟.独一味中苯乙醇苷提取物的镇痛抗炎作用及毒性研究[J].华西药学杂志，2015（3）：384.

[3] 魏刚，蔡庆群，黄月纯，等.川芎饮片及其煎剂HPLC指纹图谱的相关性研究[J].中国实验方剂学杂志，2011（2）：46.

[4] 李隆云，占堆，卫莹芳，等.濒危藏药资源的保护[J].中国中药杂志，2002，27（8）：4.

[5] 白蓉，郭延伟.独一味中苯乙醇苷提取物的镇痛抗炎作用及毒性研究[J].华西药学杂志，2015（3）：384.

[6] 郑亚男，杜文杰，尹雪霏，等.独一味不同有效部位抗炎镇痛作用比较[J].时珍国医国药，2015（2）：282.

[7] 朱斌，龚念，彭崇胜，等.独一味镇痛作用及其有效成分研究[J].中国药理学与毒理学杂志，2012（3）：442.

[8] 钟世红，古锐，王铃鑫，等.HPLC同时测定独一味中7种成分含量[J].中国中药杂志，2014，39（22）：4373.