紫花地丁中的抗补体生物碱类成分研究

杜冬生+程志红+陈道峰

[摘要] 研究中药紫花地丁Viola yedoensis的抗补体活性成分。采用硅胶、Sephadex LH-20等柱色谱方法，从紫花地丁全草95%乙醇提取物中分离得到15个化合物，通过波谱数据鉴定为生物碱类化合物，分别为：neoechinulin A（1）、N-benzoyl-L-p-hydroxy-phenylalaninol（2）、金色酰胺醇酯（3）、金色酰胺醇（4）、伞形香青酰胺（5）、栝楼酯碱（6）、吲哚-3-甲酸甲酯（7）、3-吲哚甲酸（8）、N-反式对羟基苯乙基阿魏酰胺（9）、N-p-香豆酰酪胺（10）、7′-（3′，4′-dihydroxyphenyl）-N-[（4-methoxyphenyl）ethyl]propenamide（11）、cannabisin F（12）、N-（4-hydroxyphenethyl）octacosanamide（13）、N-（4-hydroxyphenethyl）hexacosanamide（14）和N-benzoyl-L-phenylalaninol（15）。除化合物3和4外，其余化合物均为首次从该植物中分离得到。化合物1～6， 8～12对补体系统的经典和旁路途径有不同程度的抑制活性：对经典途径的CH50在0.12～0.33 g·L-1，对旁路途径的AP50在0.22～0.50 g·L-1。对补体作用靶点研究表明，不同生物碱化合物其作用于补体的靶点不同。

[关键词] 紫花地丁； 抗补体； 生物碱； 酰胺

[Abstract] Fifteen alkaloids were isolated from the 95% ethanol extract of the whole plants of Viola yedoensis by various column chromatographic techniques such as silica gel and Sephadex LH-20. Their structures were identified as neoechinulin A（1），N-benzoyl-L-p-hydroxy-phenylalaninol（2），aurantiamide acetate（3），aurantiamide（4），anabellamide（5），trichosanatine（6），indole-3-carboxylic acid methyl ester（7），3-carboxyindole（8），N-trans-feruloyl-tyramine（9），paprazine（10），7′-（3′， 4′-dihydroxyphenyl）-N-[（4-methoxyphenyl）ethyl]propenamide（11），cannabisin F（12），N-（4-hydroxyphenethyl）octacosanamide（13），N-（4-hydroxyphenethyl）hexacosanamide（14）and N-benzoyl-L-phenylalaninol（15）. All the compounds except 3 and 4 were isolated from this plant for the first time. These alkaloids exhibited anti-complement activity against the classical pathway（CP）and the alternative pathway（AP）with the CH50 and AP50 values ranging from 0.12 to 0.33 g·L-1 and 0.22 to 0.50 g·L-1， respectively. Preliminary mechanism study using complement-depleted sera showed that these alkaloids acted on different complement components in the complement activation cascade.

[Key words] Viola yedoensis； anti-complement； alkaloids； amides

紫花地丁為堇菜科植物紫花地丁Viola yedoensis Makino的干燥带根全草，味苦、辛，性寒，具有清热解毒、凉血消肿等功效；用于治疗黄疸内热、疔疮肿毒、喉痹肿痛等疾病[1]。现代药理研究表明，其具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗凝血、调节免疫等作用[2-3]。紫花地丁的化学成分主要有黄酮及其苷类和香豆素类等[2-3]。为了进一步了解紫花地丁的化学成分，本课题组对其进行了系统的化学成分研究，前期报道了从紫花地丁中分离鉴定的10个倍半萜类化合物[4]和6个黄酮碳苷类化合物[5]。本研究从紫花地丁全草的95%乙醇提取物中分离得到15个生物碱类化合物，分别鉴定为neoechinulin A（1）、N-benzoyl-L-p-hydroxy-phenylalaninol（2）、金色酰胺醇酯（3）、金色酰胺醇（4）、伞形香青酰胺（5）、栝楼酯碱（6）、吲哚-3-甲酸甲酯（7）、3-吲哚甲酸（8）、N-反式对羟基苯乙基阿魏酰胺（9）、N-p-香豆酰酪胺（10）、7′-（3′，4′-dihydroxyphenyl）-N-[（4-methoxyphenyl）ethyl]propenamide（11）、cannabisin F（12）、N-（4-hydroxyphenethyl）octacosanamide（13）、N-（4-hydroxyphenethyl）hexacosanamide（14）和N-benzoyl-L-phenylalaninol（15）。这些化合物除3和4外，均为首次从该植物中分离得到。对这些生物碱类化合物抗补体经典途径和旁路途径的抑制活性进行了研究；在此基础上对部分活性较强化合物作用于补体系统的靶点进行了初步研究。endprint

1 材料

JASCO P-1020型全自动旋光仪；Agilent SLG1946D型质谱仪；Bruker DRX 400型核磁共振光谱仪；上海通微EasySep-1010型半制備液相色谱仪；柱色谱硅胶H（200～300 目）为青岛海洋化工厂生产；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶为瑞典Pharmacia公司生产；反相柱色谱硅胶填料为日本YMC公司生产；薄层色谱板为烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂生产；石油醚、丙酮、乙酸乙酯、乙醇等试剂为分析纯。

紫花地丁购自上海华宇药业有限公司，经复旦大学生药学教研室程志红副研究员鉴定为堇菜科植物紫花地丁V. yedoensis的干燥带根全草，凭证标本紫花地丁（No. DH2008082905）保存于复旦大学药学院生药学教研室。

2 提取和分离

干燥紫花地丁全草20 kg，室温下以95%乙醇渗漉提取4次，减压浓缩得浸膏812 g；浸膏悬浮于蒸馏水中，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，得到石油醚萃取物323 g、乙酸乙酯萃取物180 g。

乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮（0∶100～1∶1）梯度洗脱，得到7个部分（Fr. 1～Fr. 7）。Fr. 4（石油醚-丙酮20∶1洗脱部分，12.4 g）经硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯（50∶1～5∶1）梯度洗脱，其中石油醚-乙酸乙酯（20∶1）部分经反复硅胶柱色谱及Sephadex LH-20凝胶柱色谱（二氯甲烷-甲醇，1∶1）分离纯化得到化合物1（15 mg），2（20 mg），3（14 mg），4（20 mg），5（67 mg），6（8 mg），7（16 mg）；石油醚-乙酸乙酯（10∶1）部分经反复硅胶柱色谱分离纯化得到化合物8（9 mg），9（18 mg），10（5 mg），11（8 mg），12（8 mg），13（19 mg），14（8 mg）。Fr. 5（石油醚-丙酮10∶1洗脱部分，21.5 g）经硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯（20∶1～5∶1）梯度洗脱，其中石油醚-乙酸乙酯（20∶1）部分经反复硅胶柱色谱及Sephadex LH-20凝胶柱色谱（二氯甲烷-甲醇，1∶1）分离纯化得到化合物15（39 mg）。

3 结构鉴定

4 体外抗补体活性与补体作用靶点研究

4.1 经典途径和旁路途径抗补体活性测定[19] 抗补体活性测定按照本课题组前期报道的方法进行。测定了所有化合物1～15的抗补体活性，结果见表1。化合物1～6和8～12对补体系统的经典和旁路途径有不同程度的抑制活性，CH50和AP50分别为0.12～0.33 g·L-1和0.22～0.50 g·L-1。这些酰胺类生物碱可分为含有苯酰胺片段（2～6，15）和苯丙酰胺片段（9～14）2种，存在苯酰胺片段的化合物中伞形香青酰胺（5）活性最强，CH50和AP50分别为（0.12±0.07） g·L-1和（0.22±0.06 ） g·L-1，其次是3，4，6。具有苯丙酰胺片段的化合物中cannabisin F（12）活性最强，CH50和AP50分别为（0.16±0.07），（0.26±0.11） g·L-1，其次是10，9，11。本文中的酰胺生物碱类化合物抗补体活性为首次报道。

4.2 部分活性化合物的补体作用靶点确定[19] 为进一步了解这些抗补体活性酰胺生物碱的补体抑制作用，本研究也按照本课题组前期报道的方法分别选取含苯酰胺片段的化合物4和5以及含苯丙酰胺片段的化合物9和10进行抗补体作用靶点的研究，结果见图1。对于补体系统的C1q，C2，C5，C9组分，化合物4的靶点组较相应缺失血清组溶血能力未能恢复；而对于C3和C4组分，化合物4的靶点组较相应的缺失血清组溶血能力显著恢复，表明化合物4作用于补体系统的C1q，C2，C5，C9组分，见图1A。类似的，化合物5，9，10分别作用于补体的C1q，C2，C3，C5，C9，见图1B；C1q，C3，C9，见图1C；和C1q，C3，C5，C9组分，见图1D。这4个化合物均作用于补体系统的C1q和C9组分，不同之处在于是否还同时作用于补体的C2，C3或C5组分。该研究表明，尽管这些化合物均具有抗补体活性，但是其在补体作用靶点上并不完全相同。

5 讨论

本研究从紫花地丁全草95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位分离鉴定了15个酰胺生物碱类化合物，其中13个化合物为首次从紫花地丁中分离得到。同时对分离得到的所有化合物进行了体外抗补体经典途径和旁路途径的抗补体活性筛选，进而对部分活性化合物的补体作用靶点进行了初步研究。结果表明，11个化合物能够不成程度地通过经典途径或旁路途径发挥抗补体作用。且补体作用靶点研究表明，这些活性化合物的补体作用靶点并不完全相同，提示紫花地丁中不同的化合物可通过抑制补体不同靶点或多靶点发挥抗补体作用。

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[责任编辑 丁广治]endprint