银杏二萜内酯K抗血小板聚集及神经保护作用研究

陶晓倩+曹泽彧+曹亮+萧伟

[摘要] 观察不同浓度的银杏二萜内酯K（GK）对血小板活化因子（PAF）诱导血小板聚集的拮抗作用及对缺血再灌注损伤细胞和动物模型的神经保护作用。制备GK家兔含药血清， 用血小板聚集功能测定法观察GK含药血清对PAF诱导的家兔血小板聚集的影响。建立缺糖缺氧复氧（OGD/R）细胞模型，采用Hoechst/PI双染考察不同浓度的GK对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞凋亡的影响；建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型（I/R），检测GK对神经行为评分及脑梗死体积的影响。GK能剂量依赖性的抑制PAF诱导的血小板聚集，逆转OGD/R损伤造成的细胞凋亡并改善大鼠脑缺血再灌注損伤后的神经行为评分及脑组织梗死体积。GK能抑制PAF诱导的血小板聚集、改善脑缺血再灌注神经损伤。

[关键词] 银杏二萜内酯K； 血小板活化因子； 细胞凋亡； 缺血再灌注

[Abstract] To investigate the antagonism effects of different concentrations of ginkgolide K（GK） on platelet activating factor （PAF）-induced platelet aggregation and neuroprotective effect on cells and animal models of ischemia-reperfusion injury. GK-containing serum in rabbit was prepared， and the effects of GK-containing serum on PAF-induced platelet aggregation was observed by platelet aggregation assay. The effect of different concentrations of GK on apoptosis of SH-SY5Y cells injured by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation （OGD/R） was investigated by Hoechst 33342/PI double staining in OGD/R cell model. The focal cerebral ischemia-reperfusion model （I/R）was established in rats to detect the effects of GK on neurobehavioral scores and cerebral infarction volume. GK could inhibit PAF-induced platelet aggregation， reverse the apoptosis induced by OGD/R injury and improve the neurobehavioral score and cerebral infarction volume after cerebral ischemia-reperfusion injury in rats in a dose-dependent manner. GK can inhibit PAF-induced platelet aggregation and improve nerve injury after cerebral ischemia-reperfusion.

[Key words] ginkgolide K； platelet activating factor； apoptosis； ischemia reperfusion

银杏二萜内酯是银杏叶提取物中治疗急慢性脑功能不全及其后遗症的一类主要有效物质，目前从中已鉴别出的成分包括银杏二萜内酯A，B，C，M，J，L，P，Q[1]，从结构上来属于具有共同母核结构的二萜内酯类成分。前期药理研究报道证实，银杏二萜内酯是具有高度专属性的、天然的血小板活化因子（PAF）受体拮抗剂，能明显抑制由PAF诱导的血小板聚集，防止血栓形成。可用于脑卒中、神经系统疾病等疾病的治疗[2-3]，尤其是银杏二萜内酯B（ginkgolide B，GB） 被证实是最有效的PAF受体拮抗剂[4]。此外，部分研究还发现银杏二萜内酯类成分对损伤的神经元具有保护作用，能改善急慢性脑功能所导致的记忆减退和痴呆等后遗症[5-6]。因此，银杏叶中的二萜内酯类成分对急慢性脑功能不全疾病发展过程中的血小板聚集和神经损伤方面比较好的改善作用。

银杏二萜内酯K（ginkgolide K，GK）为银杏叶中提取到的新的二萜类成分[7]，其结构与目前已知的银杏叶中二萜内酯类成分具有共同的母核结构。因此，基于“相似结构的成分可能具有类似的药理活性”，推测GK可能具有类似的抗血小板聚集和改善急慢性脑功能不全中神经损伤的作用。为此，本文通过建立PAF诱导的血小板聚集及体内外模拟缺血缺氧再灌注模型研究GK的抗血小板聚集和神经保护活性。

1 材料

1.1 动物及细胞株

新西兰家兔，体质量（2.0±0.2） kg，雌雄各半，购自南京市江宁区青龙山动物养殖场提供，许可证号SCXK（苏）2012-0008；SD大鼠，雄性，250～280 g，浙江省实验动物中心，许可证号SCXK（浙）2014-0001；人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）购于中国科学院上海细胞库。

1.2 药品与试剂

GK和GB（自制，纯度≥90%）；血小板活化因子（PAF，批号BCBM4010V）、Hoechst33342（批号021206）、Propidium iodide（PI，批号094K3731）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，批号T8877-100g）购于Sigma公司； RPMI 1640 培养基（批号1165062）、胎牛血清（批号1403447）购于Gibco公司；银杏提取物注射液（EGB，金纳多注射液，批号6580199）购于德国舒培大药厂；水合氯醛（批号20140827，国药集团化学试剂有限公司）；其他试剂均为分析纯。endprint

1.3 仪器

LG-PABER-I 血小板聚集凝血因子分析仪（北京世帝科学仪器公司）；80-2台式低速离心机[上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂]；Artorius分析天平（北京多利斯天平有限公司）；SW-CJ-2F超净工作台（上海博讯实业有限公司）；3111型二氧化碳培养箱（Thermo公司）；XDS-1型倒置显微镜（重庆光学仪器厂）；countess细胞自动计数仪（Invitrogen公司）；LDZ5-2型离心机（北京京力离心机有限公司）；Image Xpress高内涵设备（MD公司）。

2 方法

2.1 GK对PAF诱导家兔血小板聚集的影响

2.1.1 藥品配制 GK和GB使用前用0.5%葡甲胺80 ℃水浴溶解，10%柠檬酸水溶液调节pH至8.0，用江苏康缘药业股份有限公司提供的银杏二萜内酯葡胺注射液溶媒（含0.5%葡甲胺与0.15%柠檬酸）定容，微孔滤膜过滤，4 ℃保存1 周内用完；临用前以无菌生理盐水稀释至所需浓度；银杏提取物注射液（EGB），规格 17.5 mg，银杏提取物5 mL/支，取1支进行1.5倍稀释，作为大鼠脑缺血再灌注模型给药。

2.1.2 含药血清的制备 30 只新西兰家兔，雌雄各半，根据体质量随机分为6组： GKⅠ（0.01 mg·kg-1）组、GKⅡ（0.04 mg·kg-1）组、GKⅢ（0.16 mg·kg-1）组、GKⅣ（1 mg·kg-1）组、GB（4 mg·kg-1）和生理盐水组。耳缘静脉注射给药，每组动物分别给予相同体积的药物或生理盐水0.5 mL·kg-1，1 次/d，连续5 d，末次给药前禁食12 h，药后2 h 取耳中央动脉血10 mL，室温静置2 h，离心（4 ℃，2 500 r·min-1，10 min）分离后的家兔血清于56 ℃水浴中30 min 灭活，分装，-70 ℃冰箱冻存备用。

2.1.3 家兔洗涤血小板悬液的制备 家兔用利多卡因局部麻醉，手术分离颈总动脉取血，采取3.8%枸橼酸钠1∶9抗凝，以500 r·min-1离心10 min，取上层富含血小板血浆，加等体积的磷酸缓冲液（KH2PO4 0.22 g，Na2HPO4 0.86 g，柠檬酸0.86 g，葡萄糖0.44 g，溶于500 mL 蒸馏水中，pH 6.5）混匀，在4 ℃，以3 000 r·min-1离心10 min，取沉淀，用等体积的磷酸缓冲液混匀，4 ℃，3 000 r·min-1离心5 min 后弃上清，取血小板沉淀，重复洗涤1 次；取沉淀的血小板加入含有0.1 %小牛血清和1 mmol·L-1的MgCl2的磷酸缓冲液中，稀释成（2.5～6）×107 mL-1的洗涤血小板悬浮液（WP）备用。

2.1.4 含药血清对PAF诱导的血小板聚集作用的影响 取WP 200 μL 和样品（对照管加入生理盐水，给药管加入相同体积的含药血清）50 μL 混匀，温孵5 min 后，以5 μL PAF（终浓度为1×10-4 mol·L-1）为诱导剂，观察WP在5 min 内的聚集程度，测定5 min内最大聚集率。每个样品平行作3管，取均值，并与对照管比较，计算含药血清对PAF 诱导的家兔血小板的聚集抑制率。

血小板的聚集抑制率= （对照组5 min内最大聚集率-待测样品组5 min内最大聚集率）/对照组5 min内最大聚集率×100%

2.2 GK对缺糖缺氧损伤的SH-SY5Y细胞的影响

2.2.1 细胞培养，OGD/R 模型和给药SH-SY5Y 细胞培养于RPMI 1640 培养基（含体积分数为10%胎牛血清，100 kU·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素） 中，置于37 ℃，含5% CO2的细胞培养箱中培养，选取对数生长期细胞进行实验。将SH-SYSY 细胞接种至细胞板中培养24 h，以无糖平衡盐溶液完全置换RPMI 1640 培养基置于缺氧小室中，将小室用95% N2和5% CO2混合气，以20 L·min-1的气流速度充气20 min 以排出空气，密封小室，将小室和对照组细胞置于37 ℃，5% CO2的细胞培养箱中。将细胞在缺氧小室中培养一定的时间后，取出细胞板置于细胞培养箱中，和GK，EGB药物一起复氧一定时间，然后进行Hoechst33342/PI染色检测细胞凋亡。

2.2.2 Hoechst33342/PI双染 将SH-SY5Y 细胞以每孔2×104的密度接种至96 孔板中，OGD 4 h 后加入终浓度为5，20，80 μmol·L-1的GK和25 mg·L-1的EGB，一起复氧1 h 后，弃掉板中所有液体，无血清培养基洗板1次，各孔加入100 μL的 Hoechst33342/Propidium iodide 染液（Hoechst33342终质量浓度10 mg·L-1，Propidium iodide 终质量浓度15 mg·L-1，体积比为1∶1），避光，放入细胞培养箱中孵育0.5 h 后，无血清培养基洗板一次，每孔加入100 μL 无血清培养基，高内涵设备拍照（4×，4 视野/孔），进行数据分析，计算阳性细胞率，即PI染色数/Hoechst染色数×100%。

2.3 GK对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用

2.3.1 动物分组及模型构建 SD大鼠80只，随机分为假手术（Sham） 组、I/R 组、GKⅠ（0.02 mg·kg-1）组、GKⅡ（0.1 mg·kg-1）组、GKⅢ（0.5 mg·kg-1）组、GKⅣ（2 mg·kg-1）组、GKⅤ（4 mg·kg-1）组、EGB（8 mg·kg-1） 组，每组10只。其中给药组在大鼠造模完成后次日给予尾静脉注射治疗，3 mL·kg-1，每天1次，共3 d。

取大鼠用10%水合氯醛（35 mg·kg-1，3.5 mL·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠、仰卧位固定、备皮、碘伏消毒，颈部正中略偏右0.5 cm纵行切口，切口长约2.5 cm，钝性分离皮下结缔组织和肌肉，游离右侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA）。在颈外动脉远心端结扎，并用电凝笔凝断，留一残端；在颈外动脉上剪一小口插入栓线，栓线沿颈外经过分叉处、颈内动脉缓慢送往颅内至大脑中动脉的起始部位，以阻断中动脉的血流，进线长度自颈总动脉分叉处18～20 mm，在剪口处结扎固定栓线；将手术大鼠放在加热器前保温，缺血90 min时用乙醚麻醉，轻轻拔出栓线，ECA残端结扎，缝合大鼠。假手术组操作同上，仅暴露各组血管，而不进行线栓插入。endprint

2.3.2 神经功能缺失体征评分 参考Longa及Bederson的5分制法72 h进行评分。神经功能完全正常为0分；提起鼠尾，手术对侧前肢屈曲，无法完全伸直为1分，躯体向手术对侧扭转为2分；将鼠置于地面，行走时向手术对侧转圈为3分，向手术对侧倾倒或无法自主行走，意识障碍为4分；死亡为5分。分值越高，说明动物行为障碍越严重。

2.3.3 脑梗死面积检测 脱颈椎处死大鼠，开颅取脑组织（去除嗅球、小脑、低位脑干），称湿重，将脑组织放入-20 ℃冰箱中速冻20 min，稍硬便于切片；切成6片，每隔2 mm切1片。第一刀在脑前极与视交叉连线中点处，第二刀在视交叉部位，第三刀在漏斗柄部位，第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间；将脑片置于TTC中，37 ℃避光染色30 min，间隔15 min翻转脑片，用甲醛置换染液固定脑片；3 h后，拍照。

2.4 数据处理

资料数据以±s表示，所有数据采用SPSS 16.0统计学软件进行分析，用One-way ANOVA检验进行单因素方差分析。

3 结果

3.1 GK对PAF诱导家兔血小板聚集的影响

与生理盐水组相比，GKⅠ-Ⅳ组各含药血清能明显抑制PAF诱导的血小板聚集（P<0.01），并呈剂量依赖性，随着药物浓度的提高，对血小板聚集的抑制作用逐渐增强，且抑制效果优于GB组，见表1。

3.2 GK对缺糖缺氧损伤的SH-SY5Y细胞的影响

OGD/R（模型组）的阳性细胞率高达48%，与溶剂对照组（2.33%）相比，细胞调亡显著（P<0.01），造模成功；与模型组相比，GK各剂量组与EGB组均能显著逆转缺氧复氧造成的细胞凋亡（P<0.01），且GK有明显的剂量依赖关系，见图1，2。

3.3 GK对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用

3.3.1 神经功能缺失体征评分 GKⅠ～Ⅴ组和 EGB组大鼠神经功能缺失体征评分较I/R组（模型组）大鼠均有显著的降低，且差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），GK存在明显的量效关系；当GK上升到较大浓度（4 mg·kg-1）时，其活性基本处在一个平台期，见表2。

3.3.2 脑梗死面积检测 大脑经TTC染色后，正常脑组织呈鲜红色，而梗死组织则呈白色，且界限分明。TTC染色结果见图3，与假手术组相比，I/R组、GKⅠ～Ⅴ组和EGB组均出现不同程度的脑梗死，说明模型造模成功。而与I/R组相比，GKⅠ～Ⅴ组和EGB组大鼠的脑梗死面积均有明显减小（P<0.05或P<0.01），见表3。

4 讨论

血小板聚集是指血小板被活化后相互之间黏附形成聚集物的现象，是形成血栓的重要原因。在脑缺血发生时，PAF可以激活和聚集血小板，并释放血管活性物质如组织胺、白三烯等，进一步加重脑水肿以及血管栓塞；PAF可以使神经元膜内外离子失衡，导致其功能紊亂，产生细胞源性脑水肿，同时可以阻断神经元内线粒体的氧化磷酸化作用，导致神经元的死亡[8]；PAF能够趋化并激活白细胞释放炎性介质，同时还可刺激白细胞产生自由基，二者相互作用能够加重组织损伤并且加速炎症进展[9]；PAF还能够加重兴奋性氨基酸毒性，对神经细胞造成进一步损伤[10]。PAF的上述作用相互影响，互相促进，从而在脑缺血发生时形成恶性循环，进一步加重脑损伤。PAF主要是通过与细胞膜表面的PAF 受体结合而发挥生物效应，PAF受体拮抗剂则能拮抗或阻断PAF 与受体结合，阻止PAF发挥生物学效应[11]。GB为公认的的PAF受体拮抗剂，对PAF诱导的血小板聚集有明显的抑制作用[12]。本研究发现：含GK药物血清对PAF诱导的洗涤血小板聚集的抑制作用明显增强且在小剂量（0.01～0.16 mg·kg-1）

下存在明显的剂量依赖关系，随着剂量增加到1 g·L-1，抑制活性依然呈上升趋势但增加幅度降低。提示GK可能也是一种PAF受体的拮抗剂，且活性优于阳性药GB。

GK既然对血小板聚集有一定的抑制作用，推测对脑缺血损伤可能也存在保护作用。本研究建立体外细胞和体内动物模型来模拟缺血缺氧再灌注损伤来阐述GK在神经保护方面的作用。SH-SY5Y细胞的OGD 模型是模拟缺血性脑卒中的经典模型，已成为离体水平研究脑缺血损伤机制及药物作用的重要手段。荧光染料 Hoechst 33342 是一种可以穿透细胞膜，嵌入细胞核 DNA 的细胞核染料，能少量进入平常的细胞膜，使其染上低蓝色，凋亡的细胞呈亮蓝色，碘化吖啶（propidium iodide，PI）不能通过活细胞膜，但却能穿过损坏的细胞膜而对核染色，即坏死细胞可被 PI 着色，呈红色。二者的比值（在此用细胞阳性率表示）在一定程度上可以代表细胞的凋亡程度。本研究发现，SH-SY5Y 细胞OGD/R损伤后，与对照组比，阳性率明显升高，说明细胞凋亡水平明显增加。GK可浓度依赖性地提高OGD/R损伤神经细胞的活性，明显降低OGD/R神经细胞的凋亡。说明GK可以抑制神经细胞的凋亡。有研究报道，GK可以通过减少ROS产生及Ca2+内流来保护PC12细胞抵抗谷氨酸诱导的损伤，同时还可以降低MDA含量，caspase-3和下调Bax/Bcl-2比值以及减少LDH的释放及抑制细胞色素C从线粒体释放到细胞质[13]。GK对于H2O2诱导的PC12损伤的保护机制[14]也与上述基本一致，有可能GK对OGD/R损伤SH-SY5Y细胞的存在相似的保护机制，但仍需要做进一步的研究证实。

脑缺血再灌注损伤后神经细胞损伤主要包括坏死和凋亡。脑梗死中心区细胞迅速坏死，周围缺血半暗带内的细胞则代谢反应性增加，易于受到继发的炎性反应、水肿、钙超载及过氧化物损害等而发生凋亡，如不及时纠正，半暗带区将难以避免成为永久性梗死灶的一部分[15]。因此，减少缺血早期梗死边缘区神经细胞的凋亡，是治疗脑缺血疾病的关键。缺血发生后，SOD活性降低，MDA含量升高，大量氧化产物降低线粒体膜电位，诱导Ca2+内流，进而改变线粒体通透性，释放相应的凋亡因子，如细胞色素C，AIF因子等，促进细胞下游凋亡因子caspase-3蛋白的过多表达，最终，破坏DNA的完整性，引起细胞凋亡[16]。本实验研究显示，与模型组比较，GK各剂量组大鼠神经功能行为学评分、脑梗死体积呈显著性降低。表明GK能改善I/R大鼠神经功能，减少脑缺血后神经损伤。endprint

综合以上研究结果，GK通过拮抗PAF的生物效应来抑制血小板聚集以及后续级联反应来降低脑缺血再灌注后造成的神经损伤并抑制脑缺血再灌注后细胞凋亡来保护神经元的损伤从而达到治疗脑缺血的目的。

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[責任编辑 孔晶晶]endprint