甲状腺微小乳头状癌组织中Bax、nm23蛋白的表达及临床意义

顾桂源+王维格+黄山

[摘要] 目的 研究甲狀腺微小乳头状癌（PTMC）组织中B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（Bax）、肿瘤转移抑制基因23（nm23）蛋白的表达及临床意义。 方法 选择2016年5月～2017年5月在南通大学附属海安医院接受手术治疗的PTMC患者的组织石蜡标本103例记为观察组，将术中切除的距离肿瘤组织≥5 cm的癌旁组织石蜡标本103例记为对照组，另选同期在医院接受手术治疗的甲状腺腺瘤（TA）患者100例记为TA组，检测并对比各组Bax及nm23蛋白的表达，分析观察组Bax及nm23蛋白的表达与其病理参数的关系，以及Bax与nm23蛋白的相关性。 结果 观察组和TA组Bax蛋白的阳性表达率均分别明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。观察组nm23蛋白的阳性表达率均明显高于TA组和对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。观察组有淋巴结转移的患者Bax及nm23蛋白的阳性表达率均分别明显低于无淋巴结转移者，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。根据Spearman法对相关性分析后发现，Bax与nm23蛋白的表达呈正相关（r = 0.617，P < 0.05）。 结论 PTMC组织中Bax和nm23蛋白表达均明显升高，且与淋巴结转移有关，此二者关系紧密，可作为监测靶点，有助于评价PTMC患者的病情及预后。

[关键词] 甲状腺微小乳头状癌；组织；Bax；nm23蛋白；表达；临床意义

[中图分类号] R736.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）12（c）-0029-04

[Abstract] Objective To study the expression and clinical significance of B lymphocyte tumor associated -2 related X protein （Bax）， tumor metastasis suppressor gene 23 （nm23） protein in papillary thyroid microcarcinoma （PTMC） tissues. Methods One hundred and three paraffin specimens of PTMC patients who was given surgery treatment in Haian Affiliated Hospital to Nantong University from May 2016 to May 2017 were selected as observation group， the resection of the tumor was ≥ 5 cm far from paraffin embedded specimens of 103 cases of tumor adjacent tissues selected was as control group， another 100 patients with thyroid adenoma （TA） who was given surgery at the same time were chosen and enrolled as TA group， the expression of Bax and nm23 protein in each group was detected and compared， the relationship between the expression of Bax and nm23 protein and pathological parameters in the observation group was analyzed， and the correlation between Bax and nm23 protein was analyzed. Results The positive expression rates of Bax protein in the observation group and the TA group were significantly higher than the control group， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. The positive expression rate of nm23 protein in the observation group was significantly higher than the TA group and the control group， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. The positive expression rates of Bax and nm23 protein in the observation group with lymph node metastasis were significantly lower than without lymph node metastasis， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. According to the correlation analysis of Spearman， it was found that the expression of Bax was positively correlated with the expression of nm23 protein （r = 0.617， P < 0.05）. Conclusion The expression of Bax and nm23 protein in PTMC tissues increased significantly， it is closely related to lymph node metastasis and both two indexes can be used as a monitoring target to evaluate the condition and prognosis of PTMC patients.endprint

[Key words] Papillary thyroid microcarcinoma； Tissue； Bax； nm23 protein； Expression； Clinical significance

近年来，甲状腺癌在我国临床上的发病率明显上升，严重影响了患者的身体健康。据统计数据显示，甲状腺在全身恶性肿瘤当中占比为1%～2%，患病群体中尤以女性居多，对患者的家庭生活及生命安全均具有较大的威胁[1]。甲状腺癌当中，源自滤泡上皮细胞者占比约为90%，而这之中以乳头状癌及滤泡型癌为主。甲状腺微小乳头状癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）是乳头状癌的一种，其在临床上也较为常见[2]。由于此病患者颈部淋巴结的转移率较高，加之这种转移机制十分复杂，既与抑癌基因的调控有关，也与受体的辅助作用有关。因此，研究PTMC的转移情况与有关蛋白表达的关系对于患者的诊治具有重大的意义[3]。由于B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（B lymphocyte tumor associated -2 related X protein，Bax）是一类促凋亡基因，肿瘤转移抑制基因23（Tumor metastasis suppressor gene 23，nm23）属于肿瘤转移的抑制性基因，本文通过分析PTMC组织中Bax、nm23蛋白的表达以及临床意义，旨在为临床诊治提供数据支持，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016年5月～2017年5月在南通大学附属海安医院接受手术治疗的PTMC患者的组织石蜡标本103例记为观察组，男41例，女62例；年龄32～69岁，平均（50.31±1.33）岁。淋巴结的转移情况：有转移者18例，无转移者85例；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期61例，Ⅲ～Ⅳ期42例。纳入标准：①患者均经术后病理学检查确诊为PTMC，且肿瘤直徑≤1 cm；②有手术指征；③年龄>30岁者；④对本次研究知情同意，并签署了同意书者。排除标准：①其他类别的恶性肿瘤者；②病历资料数据缺失者；③术前有放化疗或免疫治疗史者。将术中切除的距离肿瘤组织≥5 cm的经病理学检查为癌旁正常组织的石蜡标本103例设为对照组，另选同期在医院接受手术治疗的甲状腺腺瘤（TA）患者100例设为TA组，男40例，女60例；年龄31～68岁，平均（50.29±1.26）岁。各组患者的性别以及年龄资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。关于本次研究，医院医学伦理委员会已经作出了评审通过的批示。

1.2 研究方法

1.2.1 主要试剂 ①鼠抗人型Bax单克隆抗体（克隆号：2D2，编号：MAB-0254）；②鼠抗人型nm23单克隆抗体（克隆号：37.6，编号：MAB-0139）；③EDTA修复液（编号：MVS-0098/0099）；④MaxvisionTM/HRP型免疫组化试剂盒（编号：KIT-5030）；⑤DAB试剂盒。以上主要试剂均购自福州的迈新公司。

1.2.2 Bax及nm23蛋白表达的检测 通过免疫组化法实施测定，主要步骤为：①将石蜡标本切片、脱蜡、入水；②经抗原EDTA液热修复，再用膦酸盐的缓冲液（PBS）进行3次冲洗，3次/min；③利用3%双氧水行10 min的孵育，再进行PBS液的3次冲洗，3次/min；④清除PBS，在切片上滴入一抗，放于4℃下过夜，而后进行PBS液的3次冲洗，3次/min；⑤清除PBS，在切片上滴入MaxvisionTM/HRP，放在室温下孵育约15 min，而后进行PBS液的3次冲洗，3次/min；⑥清除PBS，经DAB显色；⑦用自来水冲洗以终止显色，再用苏木精复染，常规进行乙醇脱水和二甲苯透明，以及树胶封固处理，将PBS代替一抗用于阴性对照，将已知的阳性切片用于阳性对照。

1.2.3 评价标准 Bax蛋白阳性主要定位于细胞膜和胞浆内，nm23蛋白阳性主要定位于细胞浆内，选取每个切片的10个高倍视野，统计每个视野内的100个肿瘤细胞的阳性数目，颜色为淡黄、棕黄亦或是棕褐色记为阳性，不着色记为阴性[4]。

1.3 观察指标

对比各组Bax及nm23蛋白的表达情况，分析观察组Bax及nm23蛋白的表达与其病理参数的关系，以及观察组Bax与nm23蛋白的相关性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，相关性用Spearman法进行，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组Bax及nm23蛋白的表达情况对比

观察组和TA组Bax蛋白的阳性表达率均分别明显高于对照组，差异有统计学意义（均P < 0.05）。但观察组与TA组Bax蛋白的阳性表达率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。观察组nm23蛋白的阳性表达率均明显高于TA组和对照组，差异有统计学意义（均P < 0.05）。但TA组与对照组的nm23蛋白的阳性表达率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1、图1（封三）。

2.2 观察组Bax及nm23蛋白的表达与其病理参数的关系分析

观察组有淋巴结转移的患者Bax及nm23蛋白的阳性表达率均明显低于无淋巴结转移者，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。观察组Bax及nm23蛋白的表达与患者的性别、年龄及临床分期无明显关系。见表2。

2.3 观察组Bax与nm23蛋白的相关性分析

Spearman相关性分析后发现，Bax与nm23蛋白的表达呈正相关（r = 0.617，P = 0.013）。见图2。endprint

3 讨论

临床上，甲状腺肿瘤在内分泌科较为常见，其在内分泌系统相关病变中占据较高的比例。在甲状腺肿瘤的类别中，乳头状癌属于临床最为多见的一类发生于甲状腺的恶性肿瘤，且此类癌症的发病率正呈现出逐年增加的态势[5-6]。而临床将直径≤1 cm的乳头状癌记为PTMC，伴随对PTMC的深入研究，当前发现部分基因与PTMC的形成及进展联系紧密[7]。由于Bax是促进肿瘤细胞凋亡的基因，而nm23属于肿瘤转移的抑制性基因，分析此二者有关蛋白在PTMC组织中的表达及临床意义，有助于临床对于PTMC患者的诊治提供相应的数据支持。

当前临床上关于Bax和nm23在PTMC中的研究进展报道较少，尤其是针对nm23与PTMC关系的研究报道几乎未见报道[8]，虽然临床上对于Bax与甲状腺的关系近年来作出了一定的研究，但Bax与nm23之间的关系则不容忽视，这也是本次研究的创新点。本研究通过分析后发现，观察组和TA组Bax蛋白的阳性表达率均分别明显高于对照组（均P < 0.05），但观察组与TA组比较，差异不明显；且观察组nm23蛋白的阳性表达率均明显高于TA组和对照组（均P < 0.05），但TA组与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），这些结果提示了Bax和nm23蛋白在PTMC及TA患者中均具有明显升高的阳性表达，且nm23蛋白在PTMC患者中的阳性表达更高。分析原因，主要可能与Bax和nm23在肿瘤细胞中的作用机制有关。具体而言，Bax属于Bcl-2基因家族群体当中具有代表性的促凋亡基因，其可表达出多类亚型，可对细胞内线粒体的凋亡途径进行有效调控[9-10]。由于其表达蛋白通常定位在细胞浆内，若获得凋亡信号的刺激，则可产生同源二聚体而嵌入到线粒体膜内，致使细胞色素C从线粒体不断释放进胞质，并在一系列联结反应后形成凋亡小体，最终使得细胞凋亡。nm23属于肿瘤转移的抑制性基因，其可通过对磷酸二核苷激酶和组氨酸激酶的活性进行作用，致使三磷酸核苷的来源缺乏，进而使得细胞在减数分裂过程中的纺锤体形成异常，导致染色体畸变及形成非整倍体的细胞，最终介入到肿瘤的形成及转移中[11-13]。而Bax在PTMC及TA患者组织中的表达无明显差异则可能是因为伴随肿瘤组织的细胞恶性程度加剧，为了保持细胞稳态，肿瘤组织的有关细胞提升了细胞凋亡的速度，但此时细胞已无法有效维持其自我稳态，致使细胞凋亡速度的增大幅度明显低于增殖速度的增大幅度，因此无法遏制DNA的错误复制和诱导细胞凋亡，因此Bax蛋白在PTMC及TA患者组织中的阳性表达差异不大。本研究还发现，观察组Bax及nm23蛋白的表达与患者的性别、年龄及临床分期无明显关系，但有淋巴结转移的患者Bax及nm23蛋白的阳性表达率均明显低于无淋巴结转移者（均P < 0.05）。提示PTMC患者Bax及nm23蛋白的阳性表达与其局部淋巴结的转移情况有关。原因主要与Bax的促凋亡作用及nm23的癌细胞转移抑制作用有关。Bax蛋白的表达降低使得PTMC存在更加强大的侵袭能力，也更易朝局部淋巴结区域转移[14-15]。而nm23可通过对细胞骨架进行作用而干扰肿瘤细胞的运动，进而抑制其转移[16-18]。在有淋巴结转移的PTMC患者中，Bax和nm23蛋白作用效果较差，二者的表达相对更低。本研究还发现，观察组Bax与nm23蛋白的表达呈正相关（P < 0.05），再次證实Bax与nm23蛋白的表达对肿瘤细胞的作用具有一定的协同性，原因考虑是二者在细胞内的作用机制虽然不同，但总体的抑癌效果趋于一致，这在Temiz等[19-20]的报道中也有相应的结论可以证实。

综上所述，PTMC组织中的Bax和nm23蛋白的表达均明显升高，二者之间呈正相关，且阳性表达率在有淋巴结转移者组织中明显更低，临床上可将Bax和nm23蛋白作为监测靶点，对PTMC患者的病情及预后具有科学有效的评价作用。

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（收稿日期：2017-10-11 本文编辑：任 念）endprint