显色原位杂交技术在石蜡切片EBER检测中的应用

王弦

EB病毒（epstein-barr virus，EBV）为人类疱疹病毒第四型的简称，是多种恶性肿瘤（如鼻咽癌、NK/T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、淋巴上皮瘤样癌等）的病因之一，主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞。EBER是EBV编码的小RNAs，在EBV感染的细胞中有非常高的拷贝数，并且在病毒感染的各个时期都有表达[1-5]。

显色原位杂交技术（chromogenic in situ hybridization，CISH）是以设计与标本中的靶序列互补的探针为基础，利用碱基互补配对原则，通过杂交、酶标显色，从而确定标本中是否有目的核酸片段的一种检测方法。笔者所在单位于2010年开展显色原位杂交技术检测石蜡切片中EBER，在此结合其近年的制片工作经验，将本实验中常见问题及注意事项进行介绍与探讨。

1 材料与方法

1.1 材料收集

选取安徽医科大学病理学科2014年6月—2016年3月 40例鼻咽部病理活检组织，2名中级以上职称病理医生阅片，依据阿克曼外科病理学组织学类型分别为15例鼻咽黏膜慢性炎，25例鼻咽非角化鳞状细胞癌，以上患者均未接受放射与化学治疗。所有标本均经10%中性缓冲福尔马林固定16 h，常规脱水透明浸蜡，石蜡包埋切片，切片厚度4 μm。

1.2 杂交试剂与设备

显色原位杂交试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，EBER探针为地高辛标记的RNA探针；杂交仪为美国雅培ThermoBrite原位杂交仪；正电荷黏附载玻片购自江苏世泰实验器材有限公司；孵育温箱购自上海跃进医疗器械有限公司。

1.3 实验方法

显色原位杂交法检测EBER步骤如下：（1）4 μm石蜡切片，62℃烤片2 h；（2）二甲苯脱蜡，无水酒精处理后干燥；（3）滴加胃蛋白酶工作液（预先配置），37℃消化15～30 min；（4）弃去胃酶，逐级酒精脱水，空气干燥；（5）滴加探针5～10 μl，加盖盖玻片，杂交仪中37℃ 过夜；（6）次日取出切片，置入PBST缓冲液浸泡，直至盖玻片脱落，PBST冲洗3×3 min；（7）滴加HRP-地高辛抗体，37℃ 30 min，PBST冲洗3×3 min；（8）DAB显色，适时终止；（9）苏木素复染细胞核，脱水透明，封片。

2 结果

经显色原位杂交检测，EBER阳性信号定位于细胞核，染色效果良好，无背景染色。15例鼻咽黏膜慢性炎中有2例EBER呈点状阳性（阳性率13.3%），25例鼻咽非角化鳞状细胞癌全部阳性（阳性率100%）。

3 讨论

原位杂交技术（in situ hybrization，ISH）是分子病理的一门重要技术。经过多年的发展，原位杂交技术根据探针标记物的不同，主要分为显色原位杂交（chromogenic in situ hybridization，CISH），荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）；根据所用探针和靶核酸的不同，可分为DNA-DNA杂交，RNA-DNA杂交及RNA-RNA杂交。本文检测EB病毒所采用是RNA-RNA杂交的显色原位杂交法。对于临床病理检测来说，无论是刚开展此技术的实验室还是已经熟练掌握此技术的单位都应建立自己的质控体系，现将从以下几个方面对本实验注意事项进行介绍：

3.1 良好的实验操作

工作人员具备良好的实验室经验是完成此项工作的基础，操作者应具备基本的分子生物学、免疫学和病理学相关知识结构和实践经验，专人负责，严格质控；EBER是EBV编码的小RNA，具有较高的拷贝数，大量存在于EBV潜伏感染的细胞核中，其具有稳定的二级结构，不像细胞内其他的RNA分子容易降解[6]，所以整个实验过程与以往科研实验中涉及RNA的原位杂交有所不同，但不代表完全不需要注意RNA酶的问题，所以整个实验流程尽量避免皮肤直接接触切片，应带口罩、手套进行实验操作。

3.2 完善的组织固定

对于原位杂交实验来说，组织固定最主要的目的是最大限度的保存核酸的完整。因此应选择良好的固定液以及及时有效的固定，建议组织离体以后立即投入中性缓冲福尔马林液中，固定时间一般需要在12～24 h。

3.3 良好的切片

为防止实验过程脱片，建议使用防脱载玻片，目前市场上阳离子玻片使用效果良好；同时，切片过程应完整无刀痕，为保证切片中有足够的EBER核酸拷贝数，故厚度不能太薄，一般应在3～4 μm。

3.4 组织的烤片及脱蜡

切片烤片温度应在62～65℃，温度不宜过高，烤片时间≥2 h，这样能较好的保证核酸的完整性；脱蜡应彻底，否则影响后期酶的消化以及探针的穿透。

3.5 合理的消化

众所周知，酶消化的作用是增加组织的通透和增强探针的穿透[7]。本实验选用的酶是胃蛋白酶，为保证酶的活性，建议临用临配，同时应严格按照试剂说明，以保证酶的pH值；酶在消化的过程中，针对不同的组织，时间也应有所差别，不可千篇一律[6]。为了保证消化的合理，建议在消化过程中用显微镜观察组织消化程度，当肿瘤细胞出现“荷包蛋”凸起时，方可适时终止消化。

3.6 杂交

杂交是本实验的关键步骤。笔者实验室所使用的是北京中杉金桥公司生产的EBER原位杂交检测试剂盒，为提高低拷贝数病毒的检出率，防止假阴性结果的出现，建议采用过夜杂交的方式进行，一般杂交时间≥10 h可获得较好的实验效果。因本实验是RNA-RNA杂交，不涉及DNA双链的解旋，因此没有变性的步骤，所以避免了因变性不彻底导致的杂交效率底的弊端。在滴加探针时，因气泡的出现会导致组织局部没有探针覆盖，故应防止气泡的产生，可采取将探针滴加在盖玻片上，然后采用“反吸”的方式；探针的滴加量没有固定的要求，原则是整张切片完全被探针覆盖；探针滴加盖玻片加盖之后，为防止孵育过程中干片，可以在盖玻片四周加封橡胶水泥；杂交的过程，建议有条件的单位尽量选择原位杂交仪进行[8]，原因主要有三个方面：（1）杂交仪操作便捷，相对于恒温箱而言，条件设定恒定，人为干扰因素较少；（2）杂交仪中的加热板使切片杂交温度更均匀和准确；（3）杂交仪是密闭的系统，对于切片杂交的湿度环境要求和避光环境非常适合。

3.7 杂交后洗涤及抗体孵育

杂交后洗涤要充分彻底，去除盖玻片四周的橡胶水泥之后，建议直接放入洗涤液浸泡10～15 min，使盖玻片自动脱落，这样可以防止直接揭去盖玻片时粘去待检组织；洗涤液采用PBST（PBS+Tween20），Tween20是良好的表面活性剂，可以有效的去除非特异性染色背景；抗地高辛抗体孵育时间和温度应严格把握，时间过久、温度过高都会产生非特异性背景染色；抗体滴加应充分甩干切片上的缓冲液，缓冲液残留会稀释抗体出现假阴性，另外湿盒孵育要防止干片，抗体蒸发会间接导致抗体浓度提高，出现非特异性染色。

3.8 显色和苏木素衬染

抗体采用辣根过氧化物酶标记，显色时用DAB显色剂，显色时间应在显微镜下控制，避免因显色时间过久产生背景染色；由于EBER阳性定位在细胞核，所以苏木素衬染不应过深，否则影响会覆盖阳性信号，影响判读。

3.9 对照的设立

在正确实验操作的基础上，建议每一张切片都附上阳性质控对照，可以选用日常工作中积累的已经确定的阳性蜡块，也可以采用液态阳性对照[9]。

综上所述，显色原位杂交技术检测石蜡切片中EBER是目前诊断EB病毒感染的最有效、最准确的方法，我们在实验中须准确掌握实验原理、把握实验技巧、优化实验流程及设置合理对照，才能制作出良好的切片，为诊断提供有效依据。

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