miRNA-33对脂代谢的调节

张海滨 朱磊

机体脂代谢是受相关调控因子严格控制的生理机制，一旦发生脂代谢紊乱就会导致肥胖以及动脉粥样硬化等疾病，严重影响 人体健康水平。miRNA在脂代谢相关疾病中能够抑制基因表达，从而调节病理进程。其中，miR-33是生物体脂代谢发挥调节作用的重要控制基因。miR-33能够维持体内胆固醇动态稳定，参与高密度脂蛋白(HDL)生成，以及调节脂肪酸氧化和胰岛素信号释放。目前国内外研究公认，低氧暴露、低氧训练能够有效改善机体脂代谢水平。最新研究表明，低氧训练通过抑制miRNA在肥胖大鼠肝脏表达水平，参与脂代谢生理过程。低氧暴露能够显著降低血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)的含量，显著升高高密度脂蛋白(HDL)的含量，增加血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。低氧训练可使肥胖SD大鼠肝脏胆固醇逆转运至血液中，并促进脂肪酸氧化。在研究过程中，缺氧训练显着降低了miR-33在大鼠肝脏中的表达，但对miR-33在低氧训练调控脂代谢通路中的具体功能尚未进行深入研究。本文通过对miR-33，miR-33与脂代谢，以及低氧训练对脂代谢的调节进行综述，探讨低氧训练诱导miR-33调控脂代谢通路的可能机制，为低氧训练减重降脂和脂代谢相关疾病的干预提供理论依据。

1. miRNA的生物合成及转录

miRNA在哺乳动物的生物合成中，大多数miRNA基因被RNA聚合酶II(RNA Pol II)转录生成长链的初级miRNA转录物(pri-miRNA)，随后被加帽聚腺苷酸化并剪接产生pre-miRNA。另有一些miRNA也被RNA酶III(Pol III)转录。然后核糖核酸酶Ⅲ(RNase-Ⅲ)的DROSHA瞬间将pri-miRNA中间体切割成包含约70-90个核苷酸的茎环状pre-miRNA。紧接着由Ran-GTP 依赖性核转运受体 Exportin5将pre-miRNA运送至细胞质，并由细胞质中Dicer酶进一步处理以产生成熟的miRNA，其长度约为22个核苷酸。成熟的miRNA与Argonaute家族蛋白(AGO)结合形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，RISC通过不完全碱基配对使mRNA的3-UTR与miRNA的“种子”区域特异性结合，最后增强mRNA翻转和/或转录抑制。

miRNA表达受到组织特异性和发育阶段异性控制。大多数miRNA基因转录是由RNA Pol II介导的，他们的启动子在蛋白质基因编码中被认为具有序列特征和转录调控机制。事实上，高通量测序和生物信息学方法已经揭示，miRNA基因近端上游区域具有TATA盒、启动子元素、TFIIB识别元素(TFIIB recognition element，BRE)和大量转录因子结合基序。此外，最近的研究已经预测miRNA启动子区域接近转录起始位点，暗示表观遗传机制，如DNA甲基化和组蛋白修饰对miRNA表达调控的作用。为了更好地理解miRNA基因的多样性、功能和生物合成，需要关于替代、剪接启动子和miRNA基因加工的更详细信息。

2. microRNA-33

位于甾醇调节元件结合蛋白(SREBP)中的内含子miR-33有助于维持体内胆固醇平衡，影响高密度脂蛋白(HDL)生命周期，改善脂肪酸代谢和胰岛素信号释放。值得注意的是，人类基因中存在两类miR-33,一类是存在于染色体22上srebp-2基因内含子16中的miR-33a，另一类存在于染色体17上srebp-1基因内含子17中的miR-33b。然而在小鼠体内只有一类存在与srebp-2基因内含子15中的miR-33，并与人类miR-33a高度保守。尽管miR-33a/b与宿主SREBP基因共同转录以及翻译蛋白，但是完全独立调节脂代谢。肝脏是脂肪酸氧化和胆固醇生成的重要场所，而且miR-33在肝脏表达量最为显著，这些表明了肝脏miR-33对调控机体脂代谢具有重要意义。

3. miRNA-33和脂代谢

miR-33能够直接或者间接影响相关转运蛋白和催化酶的活性，参与胆固醇运输、合成和脂肪酸β氧化，在脂代谢过程中发挥关键性作用。

3.1 miRNA-33和胆固醇代谢

胆固醇转运体，ATP结合盒转运体A1 (ABCA1)促进胆固醇外流至细胞外受体，形成新生的高密度脂蛋白(HDL)颗粒。这个过程是胆固醇逆转运(RCT)的第一步，多余的胆固醇从外周细胞转运至肝脏，以便外排到胆汁和粪便中。肝脏ABCA1失活会导致小鼠体内总HDL-c严重减少。由于血浆HDL-C水平与心血管疾病呈负相关，因此ABCA1介导的胆固醇流出对于维持胆固醇动态平衡和防止动脉粥样硬化至关重要。May等，将可能与胆固醇代谢相关的miRNA和已知脂代谢转录因子进行基因分析，鉴定出人类SREBP-2内含子16的序列与miR-33相对应序列高度保守。随后运用荧光素基因转染技术，表明人类和小鼠ABCA1以及小鼠ABCG1的3-UTR区含有miR-33互补序列。利用编码miR-33的腺病毒转染实验更加确定，人类和小鼠ABCA1和小鼠ABCG1是miR-33真正地靶标基因。最后进行的体外和体内实验数据结果显示，miR-33过表达导致胆固醇向Apoa1的运输减少，说明miR-33过表达降低细胞排出胆固醇的能力。小鼠体内注射miR-33腺病毒导致ABCA1mRNA和蛋白质减少，血浆总胆固醇下降19%。与注射空白腺病毒小鼠相比，HDL-C降低29%。相反的，注射反义寡核苷酸miR-33腺病毒的小鼠体内ABCA1表达和HDL水平显著增加。这些研究数据强烈表明，miR-33调节细胞内胆固醇外流和脂蛋白代谢的可能机制是抑制ABCA1的表达。Katey等在实验过程中发现，miR-33和SREBP-2表达由胆固醇负荷协调下调。miR-33水平与胆固醇水平和ABCA1表达呈负相关，与SREBP-2mRNA水平呈正相关。并且通过检测小鼠组织和各种细胞系中的miR-33表达水平显示，除巨噬细胞外，miR-33在小鼠和人的肝脏细胞中高度表达，在内皮细胞中表达较少。但是，miR-33在人源性细胞中强烈抑制NPC1蛋白表达，而小鼠中并未有影响。此外，miR-33转染的人巨噬细胞、肝细胞和内皮细胞中ABCG1同样没有影响。保守地分析显示，小鼠ABCA1和NPC1的3-UTR中预测的miR-33靶位点高度保守，但ABCG1的3-UTR中miR-33的推定位点仅存在于小鼠中。为评估miR-33对人和小鼠ABCA1、ABCG1和NPC1的3-UTR影响，利用荧光素酶报告基因构架技术，鉴定ABCA1和NPC1为miR-33的保守靶标，而ABCG1仅为小鼠中miR-33靶标。内源性miR-33拮抗作用增加了小鼠和肝细胞中ABCA1表达和胆固醇流出至apoA1。在胆固醇过量消耗的条件下，抑制miR-33显著增加巨噬细胞和肝细胞中胆固醇流出。细胞操作miR-33表达改变巨噬细胞胆固醇流出，这是胆固醇转运途中过量胆固醇转运至肝脏的第一步。miR-33体内过表达主要影响ABCA1调控HDL生成阶段，导致血浆HDL含量逐渐下降，6天后将至22%。相反，抗miR-33表达小鼠6天后显示肝ABCA1蛋白增加50%，血浆HDL水平升高25%。因此控制体内miR-33水平可改变ABCA1表达和HDL-c的动员。这些实验结果表明，在肝脏中的HDL生物发生过程中，miR-33操纵ABCA1对循环HDL水平影响；在细胞胆固醇流出过程中，miR-33调节HDL和apoA1通过这一途径将过量胆固醇转移回肝脏进行排泄。Najaf等在研究SREBP基因调控期间发现，成熟形式的miR-33a/b与所检测的人和小鼠组织中的SREBP基因共同表达。利用siRNA转染技术，清楚地表明ABCA1表达被过量的miR-33抑制，特别是在小鼠J774巨噬细胞和人IMR-90成纤细胞中，当细胞系引入抗miR-33时ABCA1的水平显著增加。这些数据表明，ABCA1蛋白的表达受到miR-33调控。而这种调控是miR-33通过靶向ABCA1基因的3-UTR翻译抑制或mRNA降解实现。miR-33转录后抑制ABCA1导致巨噬细胞内胆固醇保留，调控胆固醇转录；而LAN-miR-33a反义处理的小鼠体内血浆HDL-c浓度明显增加。总之，此项研究表明miR-33对ABCA1进行转录后控制，对胆固醇运输和HDL合成具有重要影响。综上研究及其他独立研究证实，miR-33通过翻译抑制ABCA1、ABCG1和NPC1的表达协调控制细胞胆固醇流出，影响胆固醇反转运至肝脏的转运途径，并通过ABCA1调节体内HDL水平，增加血浆中HDL-c含量。

最新研究普遍认为，内源性的miR-33抑制是治疗动脉粥样硬化的可行性手段。Katey等评估动脉粥样硬化风险时发现，经过4周miR-33抑制处理的小鼠显示，循环HDL水平升高，细胞胆固醇逆向转运增加，血浆、肝脏和粪便胆固醇含量升高；并且粥样硬化斑块大小和脂质含量减少，炎症基因表达降低，动脉粥样硬化逐渐消退。miR-33缺失的小鼠体内ABCA1和ABCG1蛋白增加，巨噬细胞胆固醇外流加大，血浆中HDL-c含量显著升高，有效阻止动脉粥样硬化的发展。

3.2 miRNA-33和脂肪酸代谢

脂肪酸β氧化是脂代谢过程中的关键步骤，促使脂肪降解成水、二氧化碳并释放能量的过程。在对miR-33参与胆固醇代谢研究过程中惊奇的发现miR-33同样参与脂肪酸氧化。Lswblie等，在研究miR-33对胆固醇代谢影响时注意到， miR-33抑制脂肪酸氧化蛋白HADHB和CPT1A表达水平，似乎能够抑制脂肪酸的氧化。而且miR-33过表达减少了线粒体20%的β氧化，TCL分析细胞提取物时，细胞内游离脂肪酸水平和胆固醇显著增加。Alberot等在研究时证实了，miR-33参与调节脂肪酸代谢的基因。使用Pathway Studio 7软件进行基因本体和生物学关联分析，预测了miR-33参与脂肪酸β氧化的目标基因，包括CROT，CPT1A，HADHB和AMPKα。miR-33b显著抑制荧光素酶构建体CROT，CPT1A，HADHB和AMPKα的3-UTR活性以及mRNA表达。相反，表达抗miR-33b的小鼠表现出CROT，CPT1A，HADHB和AMPKα表达适度增加，尽管没有统计学意义。评估miR-33对脂肪酸β氧化的影响显示，miR-33b过表达显著降低Huh7细胞中的脂肪酸β氧化，积累更多甘油三酯。相反，抑制内源性miR-33表达增加脂肪酸β氧化速率。类似地，过度表达的miR-33在果蝇饥饿时累积了更多甘油三酯，表明miR-33从果蝇到人类都能够调控脂肪酸氧化。另有研究表明， miR-33缺陷症增加了肝脏和脂肪组织中的SREBP-1水平，脂肪酸合成和脂肪酸积累。在饮食诱导的肥胖小鼠模型中证明，miR-33治疗性沉默促进全身氧化代谢。

4.低氧训练对脂代谢的调节

已经证实，低氧训练可以有效改善脂代谢，减轻体重。低氧环境下的耐力运动上调脂肪酸β氧化关键酶CPT1的mRNA表达，改善营养性肥胖大鼠骨骼肌脂肪代谢。现阶段更多的关注点是低氧训练诱导miRNA调控脂代谢相关基因的研究。朱磊[5]等研究表明，低氧训练诱导miR-27和miR-122表达下调，PPARγ 和 PPARβ表达上调，进而影响CPT1、FAS、ACC、CYP7A1、CD36、SREBP1基因表达促进胆固醇代谢、HDL-c转运和脂肪酸氧化。并且该项目组尚未发表的研究证明，低氧训练显著降低了肝脏miR-33表达，但遗憾的是未对miR-33在低氧训练调节脂代谢中的调控进一步研究。

5.结论与展望

miR-33是脂代谢的重要调控因子，通过调控脂代谢相关基因表达促进胆固醇流出、HDL-c浓度以及脂肪酸β氧化，影响机体脂代谢水平。低氧训练刺激miRNA表达水平的改变调控脂代谢相关基因参与脂代谢。但目前关于低氧训练对miR-33表达水平的研究尚未有发表的数据，以及低氧训练调控脂代谢是否是诱导miR-33表达水平的改变导致尚未研究。因此，低氧训练干预miR-33水平表达调节脂代谢，不仅丰富了脂代谢miRNA分子学机制，而且为运动减脂降重和动脉粥样硬化治疗提供更多科学支持。