microRNA-200c在胰腺癌干细胞中的表达及作用研究

区泳芳 谢健龙

胰腺癌细胞微小核糖核酸microRNA-200c是在胰腺癌疾病患者的生理及病理的过程当中发挥着调控作用的一种物质[1-2]。当前医学研究上，对多种的肿瘤组织当中都能发现microRNA表达谱出现异常的改变情况，许多研究者认为microRNA与肿瘤发生、发展以及肿瘤的预后存在密切关联。此外，对于胰腺癌的研究中发现，胰腺癌因过强的侵袭性常常影响到预后[3-5]。在肿瘤的干细胞理论当中认为，肿瘤干细胞与肿瘤侵袭、转移存在密切的关系，甚至其可能是导致恶性肿瘤的侵袭转移的一个原因[6-7]。本研究通过分选人胰腺癌的干细胞，分析microRNA-200c的表达与作用，研究成果作以下报道。

1 材料与方法

1.1 材料

人胰腺癌的PANC-1细胞株（上海生物化学与生物学研究所）。NOD/SCID鼠（北京华阜康生物科技股份有限公司）。3450 Transwell小室（北京明阳科华生物科技有限公司）。抗人CD24-PE、CD44-APC、ESA-FITC流式荧光抗体（BD公司，美国）。流式细胞仪（贝克曼库尔特公司，美国）。荧光定量PCR仪（7700，Applied Biosystems公司，美国）。PCR扩增试剂盒（生工生物工程股份有限公司）。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）。转染试剂盒剂（Ambion公司，美国）。

1.2 肿瘤干细胞的分选

选择处于生长期的PANC-1细胞数对，先使胰酶消化，后进行离心5 min。DMEM的培养液进行重悬，并将浓度调整至1×106个/ml。以1 ml的细胞悬液配20 μL的抗人CD24-PE、CD44-APC、ESA-FITC，置于常温避光孵育处理30 min，高速离心机下进行8 min离心，分离上清液，并经过磷酸盐溶液清洗后重新制作成单细胞的悬液。完成悬液制作后采用流式细胞仪对各成分比例进行检测并分选[7-8]。

1.3 成瘤能力分析与细胞转染

将新鲜分选后对抗人CD44+ESA+CD24+细胞与PANC-1细胞计数，并随机选取20只NOD/SCID鼠随机分两组，每组各10只，每只NOD/SCID鼠皮下接种5×105个细胞。观察分析NOD/SCID鼠成瘤能力。后将microRNA-200c前体片段以及阴性的对照片段转染到NOD/SCID鼠的干细胞中。

1.4 microRNA-200c表达检测

重新对PANC-1细胞、转染microRNA-200c前体片段后NOD/SCID鼠胰腺癌的干细胞等进行分选，对细胞的总RNA进行提取并反转录成cDNA。

cDNA合成采用特异性引物microRNA-200 RT对反转录的体系进行构建，并以cDNA为模板，利用microRNA-200c特异性引物进行PCR的扩增，并利用PCR扩增试剂盒分析ct值，取得PCR扩增结果。

1.5 统计学方法

研究采取SPSS 16.0统计学软件进行分析。其中计量资料采用（进行表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NOD/SCID鼠胰腺癌干细胞分选结果

NOD/SCID鼠的瘤移植验证PANC-1细胞中分选胰腺癌干细胞具肿瘤干细胞的特性，瘤移植鼠的皮下胰腺癌干细胞瘤体积（1673.56±258.77）mm3大于移植同期的PANC-1细胞瘤体积（482.41±96.44）mm3。

2.2 microRNA-200c表达与侵袭能力

NOD/SCID鼠microRNA-200c表达量上，胰腺癌干细胞表达值（0.14±0.01）%低于PANC-1细胞表达值（0.98±0.11）%，microRNA-200c前体片段转染后24 h，胰腺癌干细胞中microRNA-200c表达量为3.52±0.51，高于转染阴性对照（0.24±0.19）%。平均穿膜的细胞数上，胰腺癌干细胞（311.00±6.93） 个 多 于 PANC-1细 胞（73.00±17.11） 个，microRNA-200c前体片段转染后24 h，microRNA-200c转染胰腺癌干细胞平均穿膜的细胞（80±12.63）个，而转染阴性对照为（309±13.53）个。转染microRNA-200c前体片段后，胰腺癌干细胞microRNA-200表达量上升，平均穿膜的细胞数上明显降低（P＜0.05）。

3 讨论

本研究通过对人的胰腺癌细胞系在PANC-1中进行分选，获得抗人CD44+ESA+CD24+细胞，并接种NOD/SCID鼠进行瘤移植实验，实验结果验证PANC-1细胞中分选胰腺癌干细胞具肿瘤干细胞的特性，瘤移植鼠的皮下胰腺癌干细胞瘤体积（1673.56±258.77）mm3大于移植同期的PANC-1细胞瘤体积（482.41±96.44）mm3。而通过细胞体外侵袭的能力检测发现，转染microRNA-200c前体片段后，胰腺癌干细胞microRNA-200c表达量上升，平均穿膜的细胞数上明显降低，胰腺癌的干细胞侵袭能力远比PANC-1细胞更高，研究表明了胰腺癌干细胞参与到胰腺癌侵袭过程。

综上所述，microRNA-200c在胰腺癌干细胞中的表达降低，microRNA-200c能够对胰腺癌的干细胞生长与减弱侵袭起到抑制的作用。

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