浅谈微生物限度检查方法适用性试验资料的规范性

张红霞 李加恒

微生物限度检查法是评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者卫生状况的重要手段和依据，其检验项目包括染菌量及控制菌的检查[1]。2015年版《中国药典》规定供试品染菌量的检查“按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定[2]”、供试品控制菌检查中的增菌培养过程需要“经方法适用性试验确定[3]”，凡是进行药品的微生物限度检查，都需要一套要求更高的真实、完整、规范的该药品的微生物限度检查方法适用性试验资料。笔者在2016—2017年监督及复核检验过程中，共收集了112份试验资料，在罗书香[4]等人进行微生物限度检查验证资料分析过后，这112份试验资料在内容完整性、规范性及严谨性等方面仍存在较多问题。为了以后微生物限度检查的顺利进行，本文就所收集到的试验资料中存在的主要问题进行统计和分析，以期在节约人力物力的基础上，保证最终检验结果的准确性。

1 存在的问题

1.1 内容不完整

无药品生产厂家信息者4个，占3.6%；无试验单位信息者和无公章者各6个，占10.8%；无试验单位联系方式者83个，占74.1%；试验资料未编号者36个，占32.1%。

1.2 检品信息不完整

未提供检品信息者和批号者各2个，占3.6%；未提供检品包装信息者33个，占29.5%；未提供批准文号者12个，占22.3%；未提供检品规格者8个，占7.1%。

1.3 存在的较多问题

无处方来源或主要成份者109个，占97.3%；无制剂方法者110个，占98.2%；无检验依据者74个，占66.1%；无实验室环境洁净度记录者111个，占99.1%；未提供试验仪器信息者11个，占9.8%；试验仪器无编码者106个，占94.6%；无校验记录者94个，占83.9%。

1.4 培养基信息存在的问题

无信息者5个，占4.5%；无适用性检查者19个，占17.0%；培养基信息不全者5个，占4.5%。

1.5 菌种资料不完整

无信息者2个，占1.8%；无菌种来源者20个，占17.9%；未提供菌种代数者6个，占5.4%；无菌落确认试验者和选择菌种错误者各7个，占12.6%。

1.6 计数方法适用性试验存在的问题

未提供方法者6个，占5.4%；方法少阴性对照者28个，占25.0%；方法选择错误者1个，占0.9%；无培养时间者10个，占8.9%；培养时间超过规定者和无培养记录者各4个，占7.2%；未按照计数方法规定“所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%”者7个，占6.3%；无回收率结果者1个，占0.9%。

1.7 其他问题

试验过程中未做供试液对照组有80个，占71.4%，其中未提供中和剂对照组结果者9个，占8.0%；试验次数不够者57个，占50.94%：其中控制菌检查方法适用性试验仅提供1次试验结果有40个，占35.7%；试验结果与结论不一致者5个（如金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌试验结果列表显示为“24%、31%、20%”和“15%、16%、14%”，而结论却为“回收率高于70%”），占4.5%；试验过程表述不完善者16个（如取供试液，采用0.5 ml试验等类似表述），占14.3%；试验用语不准确者102个（例如“适用性试验”写成“验证试验”、菌落形成单位误写成“CFU/g”），占91.1%；试验中所用培养基具体多少量不清楚者14个（如“取不少于100 ml的胆盐乳糖增菌培养基”等），占12.5%；无结论或结论不全者14个，占12.5%；药品微生物限度检查方法适用性试验资料中仍存在“胰酪大豆胨琼脂”错写成“胰络大豆胨琼脂”的情况，甚至有1份资料存在仅有不完整结论的现象。

2 讨论

2.1 资料信息

药品生产企业的名称及联系方式是表明药品质量和安全的重要内容，同品种药品不同的生产企业由于各方面的差异，微生物限度检查适用性试验方法很可能存在较大不同；验证单位信息的重要性更是不言而喻，它是各试验及复验单位的技术人员对相关标准理解及操作步骤具体实施等内容商讨的重要途径。

2.2 检品信息

待测样品信息通常应包括检品名称、批准文号、规格、包装、批号、数量、处方来源或主要成份、制剂方法、检验依据、给药途径等。历版《中国药典》都是按照给药途径、制剂方法、药物成份来制定制剂的微生物限度标准，如2015版《中国药典》[1]将“非无菌含药材原粉的中药制剂”标准中的固体口服给药制剂细分为是否含有豆豉、神曲等发酵原粉的情况，药品所含成份不同，标准亦有较大变化；中药制剂如若没有制剂方法，也就无法得知其是否含有药材原粉，相对应的标准也就大相径庭；药典明确规定“用于手术、严重烧伤、严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定”，用于表皮或黏膜是否完整的固体局部给药制剂其在需氧菌总数的标准上相差1个数量级，可见给药途径信息的重要性。

2.3 试验环境及设备

药典对微生物计数试验环境进行了明确规定，单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行检测[5]。新版药典将洁净度分为A、B、C、D四个级别，究其原因，一方面是全面与国际药典标准相接轨，另一方面是从对终产品的检验向过程控制转变，这方面的资料的缺失势必会影响整个试验数据的可信度。

112份资料中无仪器校验记录者比例较大，约占83.9%。对于微生物试验来说，温度、压力、称量、容量等都是影响试验准确性的关键参数，一台没有经过校验的培养箱、冰箱、高压蒸汽灭菌器势必会影响试验结果的准确性。

2.4 培养基及菌种

现在实验室大多使用的是商品化的成品脱水培养基，其质量依赖于其制备过程，从而影响试验结果的可靠性。所以所有配制好的培养基均应进行质量控制试验，常规项目包括pH值及适用性检查试验。

药典[1]明确规定，药品微生物检验用的试验菌均应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业派生菌株，并且明确规定工作菌株的传代次数不得超过5代，试验资料中没有菌株代数、来源等相关信息，就无法保证其正常的生物学特性，最终影响试验数据的可靠性及整个资料的完整性。

2.5 计数方法适用性试验及控制菌检查方法适用性试验

计数方法适用性试验[6]及控制菌检查方法适用性试验是整个试验过程的主体，至关重要。2015版《中国药典》较老版药典较大改动的地方是，规定供试液与菌液必须先混合若干时间后再进行计数，且明确了所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%，然而占6.3%的资料采用“在试管中加入10 ml供试液，再加入不大于100 cfu/ml的菌液1 ml”来进行试验组的计数。

3 建议

综上所述，一份完整的微生物限度检查方法适用性试验资料除以上所列主要内容外，建议还应包括下列内容：适用性试验方案的组织与实施部门及质量管理部门有关人员的签字，其过程包括方案起草、方案审核和方案批准等步骤；验证周期、有关制式文件以及偏差处理等[7]。

药品微生物限度检查同理化性质检查及有效成分的含量测定不同，其待检对象所处的环境多样，污染源复杂，污染状态也会出现差异，面对菌细胞的活体易变性，同一生产厂家生产的同一批药品污染状态会出现差异，即使同一种菌在不同的剂型中所测得的结果也各不相同。开展微生物限度检查方法适用性试验工作，更是一个极冗长繁琐、耗时耗力的过程，除要建立一个符合标准要求、操作安全的实验室外，从事微生物检验的工作人员必须经过无菌技术及基础微生物学专业知识的培训，同时建议有关部门制定相关管理制度，并定期进行抽查和考核，将考核结果利用网络等大众媒体进行公示，严格规范其相关准入制度，促进我国药品微生物限度检查规范有序的发展[8]。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].四部.北京：中国医药科技出版社，2015：145-149.

[2] 杨晓莉，李辉，马英英，等.中国药典2015年版非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法解读[J].药物分析杂志，2016，36（6）：1101-1107.

[3] 杨晓莉，李辉，马英英，等.《中国药典》2015年版非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法解读与对策[J].中国药师，2016，19（4）：748-752.

[4] 罗书香.药品微生物限度检查方法验证资料分析[J].中国药事，2007，21（7）：525-526.

[5] 张国林.药品微生物检验实验室质量控制影响因素分析[J].中国卫生产业，2017，14（19）：26-29.

[6] 田冬梅，史春辉，娄志红，等.药品微生物计数方法及方法适用性探讨[J].中国药物评价，2017，34（2）：97-99.

[7] 杨平，曾蔚欣，时正媛，等.医院药师微生物限度检查培训的实践与体会[J].中国药师，2017，20（6）：1114-1116.

[8] 柳莹，相坤.非无菌药品的微生物限度检查概述[J].世界最新医学信息文摘，2018，18（2）：34-35.