缺血前预处理改善脑缺血后再灌注损伤预后的效果研究

谢凯胜 盘庆飞 黄贤 李圣海 何秀丽

[摘要]目的 探討缺血前预处理改善脑缺血后再灌注损伤预后的效果。方法 随机选取75只健康雄性小鼠分为3组，包括假手术组（15只）、对照组（28只）、观察组（32只），其中假手术组小鼠仅结扎右侧颈总动脉，对照组、观察组小鼠均以线栓法建立小鼠脑缺血模型，并在小鼠缺血2 h后进行再灌注24 h，对照组灌注前给予生理盐水处理，观察组使用头孢曲松处理，观察三组小鼠脑组织梗死的容积、神经功能缺陷评分以及组织内白介素1β（IL-1β）炎性因子的水平情况。结果 观察组小鼠神经功能评分高于对照组，皮层脑内IL-1β水平低于对照组，脑梗死容积小于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；两组纹状体炎性因子水平及梗死容积比较，差异无统计学意义（P>0.05）；假手术组神经功能评分高于对照组与观察组，IL-1β水平低于对照组与观察组，梗死容积小于对照组与观察组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 临床在脑缺血再灌注前使用头孢曲松进行预处理，能够降低脑内IL-1β炎性因子的表达、分泌，有效减少脑梗死容积，减轻脑神经功能损失。

[关键词]预处理；损伤；缺血再灌注；脑组织

[中图分类号] R743 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）4（c）-0116-03

Effect study of ischemic pretreatment on improving the prognosis of reperfusion injury after cerebral ischemia

XIE Kai-sheng1 PAN Qing-fei1 HUANG Xian1 LI Sheng-hai1 HE Xiu-li2

1.Department of Emergency，Shiyan People′s Hospital of Shenzhen City in Guangdong Province，Shenzhen 518100，China；2.Department of Emergency，Luohu People′s Hospital of Shenzhen City in Guangdong Province，Shenzhen 518100，China

[Abstract]Objective To investigate the effect of ischemic pretreatment on improving the prognosis of cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods A total of 75 healthy male mice were randomly divided into 3 groups：sham operation group （n=15），control group （n=28） and observation group （n=32）.In the sham operation group，only right common carotid artery was ligated.In the observation and control groups，the cerebral ischemic model in mice was established by suture method.The mice were reperfused 24 hours after ischemia for 2 hours.In the control group，saline was used before perfusion，while in the observation group，ceftriaxone was applied.The infarct volume，neurological deficit scores and interleukin-1β （IL-1β） inflammatory cytokines levels in the three groups of mice were observed.Results The score of neurological function in the observation group was higher than that in the control group.The level of IL-1β in the cortex was lower than that in the control group.The volume of cerebral infarction was smaller than that in the control group，the difference was statistically significant （P<0.05）.The levels of inflammatory cytokines and infarcted volume of corpus striatum were not displayed statistical differences （P>0.05）.The scores of neurological function in the sham operation group were higher than those in control group and observation group.The IL-1β level and infarct volume in the sham operation group were also lower than those in the other two groups，，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion Application of ceftriaxone for pretreatment before cerebral ischemia-reperfusion can decrease the expression and secretion of IL-1β inflammatory factor，effectively reduce the volume of cerebral infarction，and alleviate neurological deficit.

[Key words]Pretreatment；Injury；Ischemia-reperfusion；Cerebral tissue

脑是人体中重要的功能性器官之一，也是最为耗氧的器官，但近几年脑卒中、脑梗死等疾病发病率明显上升，患者发病时脑部均会有不同程度的缺血，研究提示脑缺血是造成患者神经功能障碍、死亡的主要原因[1]。为有效减轻脑疾病患者的脑缺血，临床需及时恢复缺血区域的血液灌注，但大量研究提示缺血再灌注会对患者脑组织造成二次损伤，不仅无法起到良好的治疗效果，同时还会导致脑细胞死亡，危及患者的生命安全[2]。有学者提出对脑缺血患者再灌注前可行预处理，以减轻脑组织损失，避免脑梗死的面积扩大[3]。本研究观察头孢曲松预处理小鼠的神经损伤情况，旨在为后期临床脑缺血再灌注的治疗提供依据，现报道如下。

1资料与方法

1.1实验动物

本研究所选取的动物均购于军事医学科学院实验动物中心，体重（192.25±19.12）g，合格证号：SCXK（军）2016-0001。

1.2主要仪器与试剂

兔抗大鼠 OX-42（北京泰泽瑞达科技有限公司）、兔抗大鼠 IL-1β[派普泰克生物科技（苏州）有限公司]、兔抗大鼠 GFAP（上海谷研科技有限公司）、头孢曲松（南昌立健药业有限公司，国药准字H20023084）、小鼠抗大鼠 NeuN（Chemicon）、IL-1βELISA 试剂盒（上海吉泰依科赛生物科技有限公司）。

1.3实验分组及处理

合格健康实验小鼠30只，体重221～254 g，术前所有小鼠禁食12 h。所有小鼠称重后，以10%水合醛3.5 ml/kg于小鼠腹腔注射，麻醉后在小鼠頸正中处做切口，游离颈内外动脉及右侧颈总动脉，在充分暴露血管后将颈总动脉、外动脉近心端结扎，于总动脉分叉下方做小切口，将尼龙栓线蘸取适量肝素钠后置入，并缓慢推进，深度在19～20 mm时停止（假手术组推进深度为9 mm），将颈总动脉远心端扎紧，建立脑缺血模型。后在对照组及观察组小鼠右侧股静脉做切口置管，连接微量注射泵，在栓塞2 h后拔出尼龙栓线恢复再灌注24 h，此时对照组泵入生理盐水，观察组泵入头孢曲松，所有小鼠术中用保温毯维持体温在38℃左右。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1观察指标 观察三组小鼠脑组织梗死容积、神经功能缺陷评分以及脑内IL-1β炎性因子的水平情况。梗死容积=（对侧脑组织-患侧正常脑组织）/对侧脑组织×100%；神经功能缺陷评分：小鼠再灌注24 h后，将其提起观察小鼠动作，小鼠四爪屈伸无变化计0分，对侧前爪伸展不完全计1分，小鼠向对侧转圈计2分，小鼠向对侧倾倒计3分，小鼠无法行走、意识丧失计4分，小鼠死亡计5分。

1.4.2检测方法 脑梗死容积测定：再灌注24 h后，先对小鼠动作进行观察，后麻醉小鼠断头处死，打开其颅骨盖，剥去脑膜，取出整个大脑，以PBS溶液清洗后立即置于-20℃冷冻10 min。将冷冻后的脑组沿冠状面切成厚度2.0 mm 左右的薄片6张，将切片置于2% TTC 溶液中，并在37℃水浴下避光孵育 10～20 min，最后以4%多聚甲醛固定脑切片，时间1～3 d，将切片用数码相机拍下脑梗死图片后，以图像分析软件计算小鼠的梗死容积。

小鼠IL-1β检测：本次检测采用双抗体夹心ELISA 法，于酶标板上加入抗小鼠 IL-1β单抗，将标准品、样品中IL-1β与单抗结合，并加入生物素化抗大鼠 IL-1β，以于酶标板上形成免疫复合物，将Streptavidin（辣根过氧化物酶标记）与生物素结合，最后加入底物液，在显蓝色后加终止液硫酸，观察酶标仪450 nm 处测吸光值，通过绘制标准曲线求出标本中IL-1β浓度，取平均值。

1.5统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，三组比较采用F检验，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1三组小鼠脑梗死容积的比较

假手术组小鼠未出现脑梗死情况，观察组皮层梗死容积小于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；两组纹状体梗死容积比较，差异无统计学意义（P>0.05），观察组梗死总面积显著小于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1、图1）。

表1 三组小鼠脑梗死容积的比较（%，x±s）

A：假手术组，脑梗死总容积为0.00%；B：对照组，脑梗死总容积（38.15±1.60）%；C：观察组，脑梗死总容积（22.40±1.75）%

图1 小鼠脑梗死情况

2.2三组小鼠神经功能缺陷评分的比较

对照组神经功能缺陷评分为（8.31±0.26）分，观察组为（12.54±0.32）分，假手术组为（17.63±1.20）分，假手术组小鼠的神经功能缺损评分高于其他两组，同时观察组小鼠的评分高于对照组（F=1239.13，P<0.05）。

2.3三组小鼠脑内IL-1β炎性因子水平的比较

假手术组小鼠脑内IL-1β水平低于其他两组，差异有统计学意义（P<0.05）；观察组皮层IL-1β水平低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

表2 三组小鼠脑内IL-1β炎性因子水平的比较（pg/ml，x±s）

与假手术组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

3讨论

临床对于脑缺血患者治疗重点在于及时有效恢复缺血区域的血液灌注，但近几年随着临床深入研究，发现缺血再灌注时会对患者的脑组织造成二次损害，导致脑细胞死亡，原因为再灌注时脑细胞肿胀、破裂、坏死，而坏死脑细胞会刺激脑组织，造成大量炎性分子分泌，随着炎性因子浸润组织，引发炎症反应，诱发脑梗死、造成神经元损伤，进而危及患者的生命安全[4-6]。

缺血再灌注损伤炎症反应是引发损伤的主要原因之一，因此如何有效避免再灌注时脑部炎性细胞激活、抑制炎性因子释放，是减轻缺血再灌注损伤的关键，有学者提出在再灌注前使用药物进行预处理，可以抑制灌注时炎性因子水平上升，减轻脑损伤[7]。头孢曲松是临床常用的抗菌药物，但研究表明此药不仅有灭菌、消炎效果，还能发挥一定的神经保护作用，故有学者提出将其用于预处理，以减轻脑损伤[8-9]。本研究结果显示观察组小鼠的神经功能缺陷评分高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），提示头孢曲松能起到一定的神经保护作用。这可能是由于此药能促使细胞内谷氨酸转运体RNA（信使mRNA）表达，增加转运体含量，降低脑内谷氨酸水平，从而减少神经毒性，达到减轻脑组织损伤的目的[10-11]。研究提示谷氨酸是人体内神经兴奋性递质，大量谷氨酸释放聚集，可导致神经兴奋性毒性，造成细胞肿胀诱发脑部病变，而头孢曲松能在损伤早期清除兴奋性谷氨酸，故能减轻神经损伤[12]。同时本研究显示观察组小鼠皮层较对照组脑梗死容积小、脑内IL-1β水平低，差异有统计学意义（P<0.05），而在纹状体两组炎性因子水平及梗死容积无明显差异（P>0.05），结果提示头孢曲松可保护缺血半暗带皮层，逆转部分梗死容积、IL-1β表达。研究提示再灌注损伤早期炎性细胞激活释放IL-1β，且随着再灌注时间延长炎性细胞开始逐渐释放一系列如肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎性介质[13-14]。由于IL-1β为缺血损伤早期产生因子，可放大炎症级联效应，导致炎症因子聚集在损伤脑组织血管周围，同时IL-1β可促使机体谷氨酸释放，加重脑组织缺血、损伤，而头孢曲松可抑制炎性细胞活化，阻碍IL-1β释放，从而达到保护脑组织的目的[15]。

综上所述，临床在脑缺血再灌注前使用头孢曲松进行预处理，能降低脑内IL-1β炎性因子表达、分泌，有效减少脑梗死容积、减轻脑神经功能损失，对脑组织起保护效果。

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（收稿日期：2017-11-22 本文编辑：闫 佩）