荧光免疫层析芯片检测系统信号提取方法研究*

侯亚飞, 王 侃,2, 秦伟健, 肖 琨，颜文强，崔大祥,2

(1.上海交通大学 电子信息与电气工程学院 仪器科学与工程系,上海 200240；2.上海智能诊疗仪器工程技术研究中心，上海 200240)

0 引 言

被广泛应用于即时检测(point-of-care test，POCT)[1～3]行业的荧光免疫层析芯片具有灵敏度高、特异性强、生物相容性好、速度快等优点[3]，并且结合传感器技术和便携式检测系统可以实现标记物的定量检测。生物相关的传感器和检测系统也逐渐成为研究热点[4～6]。目前，荧光免疫层析芯片的检测系统主要基于台式计算机处理或者嵌入式技术开发，体积大，便携性差，检测速度有待提高。前期研究中，基于嵌入式技术实现的血液中C反应蛋白检测系统，整体变异系数高、稳定性差[7]。该技术实现的扫描式荧光检测系统存在检测速度慢的不足[8]。随着智能手机的普及，开发基于智能手机的快速定量芯片检测系统具有极大的应用前景[9,10]。

本文针对荧光免疫层析芯片检测系统，开发了一种应用于智能手机的荧光芯片图像特征提取和识别的方法，识别荧光芯片的信号区域并提取信号强度。实验表明:能够准确识别荧光芯片的信号区域，并准确提取信号强度。在荧光免疫层析芯片检测系统中，荧光信号强度和分析物浓度呈正相关。表明该荧光信号提取方法准确，适用于基于智能手机的荧光芯片检测系统。

1 方 法

1.1 免疫层析芯片结构

免疫层析芯片主要包括5个部分：样品垫、结合垫、硝酸纤维素((nitro-cellulose filter,NC)薄膜、吸收垫和聚氯乙烯 (polyvinyl chloride,PVC)背板。结构如图1所示。PVC背板用于提供结构支持；样品垫用于滴加待测样品；结合垫用于固定荧光免疫探针，结合垫的一部分延伸到样品垫下方，使得待测样品和结合垫上抗体充分反应；硝酸纤维素薄膜用于固定抗体和二抗，分别作为检测线(test line ,T线)和控制线(control line,C线)；吸收垫用于提供层析的动力，同时将多余的液体样品吸收，以降低对信号判读和检测的影响。

图1 荧光免疫层析芯片结构

1.2 免疫层析芯片层析原理

荧光免疫层析技术是将免疫标记技术与层析技术结合的一种新型检测技术，利用荧光标记物被激发后的荧光显色特性，实现对待测物的定性及定量分析。由于硝酸纤维素膜是微孔结构，以其为固相载体，待测液为流动相，利用微孔滤膜的毛细及虹吸作用引导待测液体向前流动，同时待测液中的相关成分和固定在NC膜上的抗原或抗体发生反应，形成免疫复合物后，滞留在检测区域，形成T线和C线。通过对标记物荧光强度进行分析，得到定量的检测结果。整个层析过程用时约2～4 min。

1.3 免疫层析芯片信号区域识别与信号强度提取

如图1所示，有效的信号区域为矩形结构，首先要确定矩形区域的坐标位置，然后再提取信号区域的荧光信号强度。通过对比多种图像处理方法，最终采取的处理步骤包括：灰度化处理，改进的Sobel算子进行卷积运算，阈值分析，二值化，投影法获取检测区域边界坐标，对信号区域的色彩值提取。算法流程如图2。

图2 图像处理算法流程

1)将色彩的红绿蓝 (red，green，blue，RGB)三通道的图像转化为单通道的灰度图像，得到灰度图像后，使用改进的Sobel算子进行卷积运算提取图像边界。对比相关边缘检测算子，对于图像边界处理改进的Sobel算子更能突显边界去除背景干扰。另外，对比了霍夫直线检测算法，虽然该算法对于检测直线有一定的优越性，而且芯片图像上以直线为主，但是该算法实际应用比较耗时。因此，最终使用改进的Sobel算子进行边界提取

(1)

2)将经过卷积运算之后的图像进行阈值分割，进行二值化处理。分别使用最佳阈值分割法、直方阈值选择法和多次实验法进行阈值计算。最佳阈值分割法单独使用效果虽好，但是比较耗时。在检测环境不变的情况下，每次处理的芯片图像结构相似，所以,将最佳阈值分割法求得的阈值作为参考值固定在程序中。然后将高于阈值的像素值置为0(黑色)，低于阈值的像素值置为1(白色)，从而实现边界区域与背景区域的分离，如图3所示。

图3 芯片坐标标识

3)进行图像中边界位置的确定(如图3标示的坐标点)。首先检测左右边界的坐标值(Left_x和Right_x，如图3所标识)。研究分别对比了2种算法：二分求极值和中心扩展法。二分求极值法，先将二值化图像矩阵中每一列像素值求和，得到一个一维数组，数组从中间分开，分别对前半部分求最大值及其对应的坐标值，得到了左右边界的坐标位置。中心扩展方法，同样将二值化图像矩阵中每一列像素值求和，得到的一维数组，从中间向两边扩展的过程中，设定一个阈值如式(2)～式(5)，一旦超过阈值T便认为找到了边界。由于边界线具有一定的宽度，二分求极值法的获取的是边界线在其宽度范围内的中心位置；中心扩展方法则计算得到的是左右边界线宽度范围内的内边距的位置。实验目的是获取信号区域，因此,界定的其边界范围要适当排除边界线的干扰，因此,第二种方法更准确一些。通过伪代码程序(1～16行)分别计算出芯片的左右边界值

(2)

(3)

(4)

(5)

式中S(xi,yj)为M×N的图像中像素值；X(i)为M×N的矩阵中第i列元素的和；Xextr1和Xextr2分别为两个极大值。

1.Int get_left_x(){

2.fromk=N/2 to 0

3.ifX(k)>T

4.left_x=k;

5.return left_x;

6.end;

7.end;

8.}

9.Int get_right_x(){

10.fromk=N/2 toN

11.ifX(k)>T

12.right_x=k;

13.return right_x;

14.end;

15.end;

16.}

4)获得T线和C线上下四条边的纵坐标(T_line_y1,T_line_y2,C_line_y1和C_line_y2，如图3所示)。采用了两步法：1)将二值化图像矩阵中每一行的像素值相加，得到一个一维数组，并用辗转求极值的方式，如式(6)～式(8)，求出的极值中找出4个最大值;2)将该坐标值从小到大排列如式(9)，其中，n1为k1～k4中最小的一个，n2为k1～k4中次小值，其他以此类推。Y(j)为M×N的矩阵中第j行元素的和；Yextr(k)为Y(j)中的极大值，则T线和C线的边界坐标对应式(10)～式(13)。

经过上述理论分析从而实现芯片有效检测区域的自动准确识别，相比于其他检测设备具有很大的进步，同时也增强了用户体验

(6)

20≤k≤N-20

(7)

Yextr(k1)>Yextr(k2)>Yextr(k3)>Yextr(k4)

(8)

Sort(k1,k2,k3,k4)=[n1,n2,n3,n4|n1

(9)

C_line_y1=n3

(10)

C_line_y2=n4

(11)

T_line_y1=n1

(12)

T_line_y2=n2

(13)

2 MATLAB模拟仿真与智能平台的仿真应用

2.1 MATLAB模拟仿真

基于上述算法理论，首先,在MATLAB上实现了模拟计算用于可行性分析，对于信号区域边界的提取方式符合预期结果。免疫层析芯片图片实际的位置坐标为left_x=170，right_x=331，T_line_y1=293，T_line_y2=350，C_line_y1=506，C_line_y2=565。图4(a)和图4(b)，将二值化图像(图3)按照每列求和和每行求和，分别得到两个曲线，其中标示出了峰值坐标，与在芯片图片的实际坐标位置一致。

图4 MATLAB芯片信号区域坐标识别

对其区域信号进行提取。对于图像的信号处理，采用RGB色彩模式，分析每一个通道数据，针对于荧光芯片，根据图5中3个通道信号强度对比，只有R通道信号最明显，G和B通道基本无荧光信号强度的体现，因此，本文只需提取相应的R通道数据进行荧光信号。

图5 荧光芯片RGB通道像素值

2.2 智能手机应用

选择基于Android系统的智能手机，采用Java编程语言，开发手机端的应用程序。最终，实际使用效果与MATLAB对比结果一致，详见表1，验证了该算法的合理、可行性。如表1所示，原图中对应的坐标位置和MATLAB计算的结果以及智能手机算法实现的结果基本一致。说明了该方法对于区域图像坐标的识别具有良好的特性。图6中，智能手机自动使用线条标示出了信号区域，完全符合预期。

表1 芯片信号区域位置坐标

图6 Android应用软件算法实现

3 实验验证

将该方法应用于基于智能手机的荧光芯片检测系统中进行实验。研究以癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)为荧光免疫层析芯片分析物，分别检测不同浓度条件下系统的荧光信号强度与浓度的相关性。样品选用浓度依次为：1，2.5，5，10，20，30，40，50 ng/mL。检测过程中，所有的信号区域均准确地标定出来。提取被标定的区域荧光信号，计算T线和C线的荧光强度之比。比值与样品浓度呈现正相关，如图7(a)所示。根据多次重复检测，计算样品浓度和T线与C线的比值的标准曲线y=0.093 8lnx+0.321 3，如图7(b)所示，二者相关系数R2=0.948。根据该标准曲线，可以实现快速、便捷的定量检测样品浓度。CEA的理论检测下限达到0.03 ng/mL，相对于其他的检测方法[11,12]，更加准确，也更好地满足临床需求。进一步验证了该算法不仅可以准确识别芯片信号区域、提取荧光信号，而且适用于芯片监测系统中。

图7 检测仪器系统定量检测结果

4 结 论

经过一系列的MATLAB仿真分析和验证，提出的荧光芯片信号区域提取方法不仅可以准确地识别荧光芯片的信号定位，而且合理地提取了荧光信号，进行处理分析，得到满意的定量检测结果。将方法应用到基于智能手机的检测程序中，可以实现快速、高效、便捷的荧光层析芯片定量检测。通过临床应用进一步验证了算法的合理性和准确性。检测方法具有很高的实用性和可移植性，可应用于不同的移动客户端芯片检测系统中，并且可方便地拓展到多指标的芯片检测系统中。

[1] 邓 均,宋世平,郑峻松,等.我国POCT发展现状与展望[J].临床检验杂志,2015,33(11):844-845.

[2] 李新军,王成彬.POCT技术的现状与发展前景[J].临床检验杂志,2015,4(2):844-849.

[3] Xie Q Y.Advantages of fluorescent microspheres compared with colloidal gold as a label in immunochromatographic lateral flow assays[J].Biosens Bioelectron,2014,54:262-267.

[4] 刘 静,杨永杰,李 丹,等.可穿戴式生理数据检测仪的研制[J].传感器与微系统,2016,35(7):76-79.

[5] 郑 宇,王 侃,张晶晶,等.金标试纸条的尿素酶快速定量检测仪研制[J].传感器与微系统,2016,35(10):97-99.

[6] You D J,Park T S,Yoon J Y.Cell-phone-based measurement of TSH using Mie scatter optimized lateral flow assays[J].Biosens Bioelectron,2013,40(1):180-185.

[7] 谢梦圆,张 军,谷 稳,等.便携式定量荧光免疫分析仪[J].仪表技术与传感器,2014(12):25-28.

[8] 赵忠龙,杨志伟,王 海,等.便携扫描式荧光仪的研发[J].厦门大学学报,2016,55(1):121-125.

[9] 张业明,陈江雪.基于安卓和单片机的智能公路警示器[J].传感器与微系统,2016,35(4):93-96.

[10] 文桂龙,宋开新.基于Android的静电式智能空气净化器系统设计[J].传感器与微系统,2016,35(7):90-93.

[11] 胡卫东,曾昭睿,胡名柏,等.SPR在检测肺癌血清CEA中的应用[J].肿瘤防治研究,2010,37(11):1303-1305.

[12] 梁臻龙,王 策,李 炯,等.基于微流控技术与酶促化学发光免疫技术检测血清CEA方法的建立及初步应用评价[J].临床检验杂志,2015,33(12):892-894.

崔大祥(1967-)，男，通讯作者，教授，长江特聘教授，博士生导师，国家杰出青年基金获得者，纳米重大科学研究计划项目首席科学家,主要研究领域为纳米材料的制备、生物学效应与安全性评价，基于纳米粒子标记与纳米效应的肿瘤早期诊断系统与传感器的研制，多功能纳米探针与肿瘤的分子影像，胃癌相关的基因与蛋白质的结构与功能研究，基于纳米技术的CIK与干细胞治疗，高效基因或药物递送系统，E—mail：wk_xa@163.com。