副猪嗜血杆菌的药敏试验

王圣花（山东省阳谷县畜牧局 252300）

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HP)，属革兰氏阴性短小杆菌，形态多种多样，副猪嗜血杆菌易感染断奶后和保育阶段的5～8周的幼猪，发病率一般在10%～15%，严重时死亡率可达50%[1]。由于当今科技飞速发展以及社会不断进步，大规模养猪业得到了空前的发展，副猪嗜血杆菌感染也随之成为影响养猪业的严重性疾病。该细菌在环境中普遍存在，流行于我国各地，使养猪业损失严重，因此该病菌感染成为危害养猪业发展的呼吸系统性疾病之一[2]。加之规模化饲养技术的不成熟和饲养密度过高，以及呼吸道病并发等因素的存在，使得该病日趋流行，危害日渐严重。本实验通过对该病原体进行鉴定以及多种药物的敏感试验，结果表明，治疗猪副嗜血杆菌病最有效的药物是头孢类抗生素，说明药敏测试在指导临床治疗中具有重要的意义。

猪副嗜血杆菌病是猪场内常见的由副猪嗜血杆菌引起的一种严重的接触性传染性疾病之一，近几年，在我国多个地区此病大肆流行，因此有必要对该细菌进行药物敏感性研究，该实验在指导临床治疗选择抗感染药物时具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验仪器 手提式、电泳仪、PCR仪、低温冰箱、低温离心机、凝胶成像仪、CO2培养箱、TD-20/20型荧光光度计、纯水仪、SHP-250生化培养箱、超净工作台。

1.1.2 主要培养基及试剂 鲜血培养基、普通平板培养基、含NAD因子培养基以及巧克力培养基，TSB来自Oxioid公司，TSA来自Difco公司。

1.1.3 药品 18种抗生素，分别为四环素、沃尼妙林、泰妙菌素、泰乐菌素、新霉素、环丙沙星、诺氟沙星、林可霉素、替米考星、氟苯尼考、头孢他啶、大观霉素、氨苄西林、青霉素、头孢噻肟、头孢噻呋钠、恩诺沙星、氧氟沙星。

1.2 抑菌圈测量和参考标准

本试验将选定的3株副猪嗜血杆菌，HPS-0，HPS-1和HPS-2分别接种于含NAD因子的TSA培养基上，均匀涂布，晾干，用高压灭菌后的镊子将18种抗生素的药敏纸片按一定的距离分别贴于培养基表面，37℃条件的 CO2培养箱中培养48h，通过卡尺测定抑菌圈的直径，通过直径大小判断药物的敏感性[5]。参考一般性细菌敏感试验的判定标准，本实验设定标准为：抑菌圈直径＜10mm，为不敏感，标记为—；抑菌圈直径≥10mm，且＜20mm，为敏感，标记为+；抑菌圈直径≥20mm，且＜30mm，为高度敏感，标记为++；抑菌圈直径≥30mm为极敏感，标记为+++。

2 结果

3株副猪嗜血杆菌对18种抗生素的敏感性测试结果如以下表1所示。总体上看，副猪嗜血杆菌对头孢菌素类抗生素最为敏感，副猪嗜血杆菌对剩余其他大部分抗生素产生严重的耐药现象。单个细菌来说，HPS-2最为敏感。

表1 HPS-0、HPS-1和HPS-2药敏试验结果

3 讨论

3.1 细菌的鉴定与培养

副猪嗜血杆菌是一种不运动、非溶血性的革兰氏阴性杆菌，形态多种多样，细长的丝状菌体、单个球杆菌，无芽孢和鞭毛，属于兼性厌氧菌。副猪嗜血杆菌在普通培养基中不生长，在胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)、巧克力琼脂平板、胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)液体培养基中生长时严格需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，副猪嗜血杆菌和金黄色葡萄球菌共同接种于鲜血琼脂平板上，在37℃条件下培养24～48h，会呈现典型的“卫星生长”现象，并且不出现溶血现象。副猪嗜血杆菌的鉴定方法一般采用糖发酵试验，半乳糖发酵、葡萄糖发酵、麦芽糖发酵结果通常均为阳性。若采用某些生化鉴定方法，副猪嗜血杆菌一般不够敏感，甚至某些反应不够稳定，常见的酶类，比如磷酸酶和接触酶为阳性结果，乌苷酸酶、氧化酶为阴性结果[3]。

3.2 血清分型与毒力研究

琼脂扩散试验和热稳定性可溶性抗原试验是常见的血清学分型方法，到目前为止，副猪嗜血杆菌有15个血清型以上，血清型5、4、13最为常见，不同的血清型其毒力强度不同，强毒株包括1、5、10、12、13、14六个血清型，具有高致病性，动物感染后，可以引起动物死亡[4]。中等毒力株包括2、4、8和15四个血清型，猪感染以后，可以引起浆膜炎，但这种疾病不会引起猪的死亡。另外，猪感染3、6、7、9和11五个血清型后，不会引起病理损伤以及明显的临床症状。影响副猪嗜血杆菌毒力的因素包括多个方面，其中，荚膜、脂多糖以及菌毛的相关报道最多。荚膜的主要成分是多糖和磷壁酸，有文献报道，从病猪上呼吸道分离得到的副猪嗜血杆菌大多具有荚膜结构，而从肺部或其它组织中提取的菌体大多数不具有荚膜结构。脂多糖(lipopolysacchride，LPS)是一种细菌菌体外表抗原，通过比较强毒力菌株和无毒力菌株的脂多糖，发现源自这两种不同菌株的脂多糖无差异，有文献报道了副猪嗜血杆菌合成的脂多糖结构，发现毒力菌株与无毒力菌株的脂多糖成分相似，通过实验研究发现菌毛与毒力关系也不成正相关，因此三者与毒力的关系还需实验研究来进一步确定。

3.3 灵活使用敏感药物

头孢类抗生素是治疗副猪嗜血杆菌最为有效的药物，但是，由于副猪嗜血杆菌血清型比较复杂，因此，针对不同地区的猪场，治疗副猪嗜血杆菌病的感染时，应根据当地病的具体情况治疗，切记效仿用药。畜主应该及时联系当地畜牧部门，进行具体的试验测试、病原体分离鉴定和药物敏感测试，可以结合当地的治疗经验，选择合适的药物进行治疗。一旦发现有可疑病猪时，可以同时采用注射和口服两种给药方式，以免由于一种给药方式起效较慢而延误最佳的治疗时间。

[1] Alex, Joaquim Segale, Virginia. Update on the diagnosis of Haemophilus parasuis infection in pigs and novel genotyping methods[J].The Veterinary Journal. 2007, 174: 522-529.

[2] 王翔, 庄艳. 猪副猪嗜血杆菌病的诊断及其综合防治[J]. 中国畜禽种业. 2010, 1: 67.

[3] Smart NL, Miniats O P. Mactnnes J I. Analysis of Haemophilus parasuis isolates from southern Ontario swine by restriction endonuclease fingerprinting[J]. Can J Vet Res. 1988, 52: 319-324.

[4] 汪联, 毛世香, 丁玉春等. 副猪嗜血杆菌的分型与毒力因子研究[J]. 兽医研究. 2010, 255: 54-56.

[5] 周斌, 储岳峰, 李超等. 华东地区副猪嗜血杆菌的分离、血清型鉴定与药敏分析[J]. Animal Husbandry & Veterinary Medicine. 2009,141(111): 84-86.