中药复方制剂“归芪饮”的急性毒性研究

2018-01-26张亚君刘文利林明明山东迅达康兽药有限公司山东济南韩征军山东省莱州市柞村畜牧兽医站马兴旺南京日升昌生物技术有限公司江苏南京

山东畜牧兽医 2018年1期

张亚君刘文利林明明（山东迅达康兽药有限公司山东济南）韩征军（山东省莱州市柞村畜牧兽医站）马兴旺（南京日升昌生物技术有限公司江苏南京）

鸡新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染疾病[1]。世界动物卫生组织(OIE)列为A类疫病，我国将其列入一类动物疫病。近年随着现代畜牧业的发展，化学药品长时间使用所导致的耐药性和药物残留问题越来越明显，鸡群长期、大剂量、多次使用疫苗，NDV在强大免疫压力和外部环境因素的影响下发生的部分抗原变异从而造成免疫失败[2]。中兽药是在独特中兽医理论指导之下用于动物疾病防治，兼有营养和药用双重功效。研究表明，复方中药可以明显提高抗禽流感、鸡新城疫抗体效价[3-4]，与西药相比具有天然性、多能性、低毒副作用、不易产生有害残留和耐药性等优点，符合绿色环保的要求，有着广阔的应用前景。

归芪饮是由黄芪、当归、淫羊藿、枸杞子、苍术、山楂六味中药材组成的中药复方制剂。经过药效试验已经证实归芪饮具有较佳的免疫增强作用，能够有效提高鸡体的细胞免疫和体液免疫功能。本试验通过对小鼠急性毒性试验，评价其在家禽上的安全性，为其临床合理利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物昆明系清洁级小鼠110只，约7周龄，雌雄各半，体重(20±2)g，由山东省实验动物中心购入。在通风良好的情况下，饲养在室温20-25℃的鼠笼中，自由饮水及采食，观察5d。试验前禁食12h，给药后4h内禁食，但不禁水。

1.1.2 试验药品 0.9%氯化钠注射液复方中药制剂“归芪饮”由山东迅达康兽药有限公司研发中心实验室研制。

1.1.3 试验器材 HX302T电子天平(慈溪市天东衡器厂)；12号灌胃针，1ml注射器；小鼠笼；小烧杯，外科器械等。

1.1.4 药液的制备将黄芪，当归，淫羊藿，枸杞子，苍术、山楂六味中药按照筛选的最佳工艺进行提取，制成水提液，浓缩得棕褐色溶液，其生药含量为1g/ml。

1.2 方法

1.2.1 小鼠口服(灌胃)急性毒性预试验将30只小鼠随机分成5组，每组6只，雌雄各半，其中1组小鼠为空白对照组，给药前禁食12h，试验组小鼠用12号灌胃针进行灌服，分别按照5、10、20、40g/kg剂量灌胃给药。连续观察7d，记录各组小鼠死亡数和存活数，找出最小全致死量100%(Dm)和最大全不致死量0%(Dn)。

1.2.2 小鼠口服(灌胃)急性毒性正式试验按照预试验结果，选取清洁级昆明系小鼠，雌雄各半，在0%～100%致死量之间随机分为多个试验组，其中1组小鼠为空白对照组。按组间剂量比值1.00:0.77分组。给药前禁食12h，试验组小鼠用12号灌胃针进行灌服。空白对照组灌服生理盐水。给药后先观察30min，在给药后的4h再观察1次，以后每天上午、下午各观察1次，观察14d。记录小鼠的异常行为及死亡只数，包括动物体重变化、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物等。对小鼠全身精神状态观察的主要内容有被毛组织光滑度、眼角膜是否有血丝、红肿现象、小鼠活动是否有异常行为，以及小鼠的神经系统、呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统等[5]。记录所有动物的死亡情况、中毒症状及中毒反应的起始时间、严重程度、持续时间、是否可逆等。对濒死及死亡动物及时进行解剖，其他动物在观察期结束后进行解剖，当发现器官出现体积、颜色、质地等改变时，则对改变的器官进行组织病理学检查[6,7]。

2 结果与分析

2.1 小鼠口服(灌胃)急性毒性预试验结果

用灌胃针口服灌入不同剂量复方中药制剂“归芪饮”后，连续观察7d，记录小鼠死亡情况(见表1)。由表1可知，最小全致死量100%（Dm）为40g/kg，最大全不致死量0(Dn)为10g/kg。

表1 小鼠口服(灌胃)急性毒性预试验结果

2.2 急性毒性正式试验结果

（1）按照预试验结果，按组间剂量比值1.000.77∶设7个试验组和1个空白对照组，每组10只小鼠，正式试验各组剂量分别为10.00、12.98、16.85、21.88、28.41、36.89、47.90g/kg，经各组给药后，与空白对照相比，在给药后的2h内观察，小鼠未表现异常，小鼠在8h内出现不同程度的精神沉郁，蜷伏、自主活动减少，闭目、反应迟钝等反应，采食饮水相对于对照组明显减少。当给药剂量大于12.98g/kg时，小鼠给药后24h内出现个别死亡，主要表现为被毛松弛，即而出现呼吸困难，频率加快呈腹式呼吸，最终呼吸抑制而死亡，部分小鼠出现腹泻、咳嗽等毒性症状。各给药组未死亡小鼠24h后精神、活动恢复正常，给药后第3天进食量即明显恢复，排便正常，无稀便。各剂量组小鼠死亡统计结果见表2。（2）对死亡的小鼠立即解剖，观察期14d结束后，和观察期满的小鼠进行解剖。观察期满存活的各剂量组小鼠与对照组相比，观察脏器有无异常。结果表明心、肝、脾、肺、肾、胸腺、肠器官无任何异常，说明停药后小鼠恢复很快。针对死亡小鼠解剖发现，小鼠肝脏肿大，被膜紧张、边缘钝圆，颜色呈暗紫色，质地变软易碎；肺部有散在出血点，其他脏器未见明显异常。按照改良寇氏公式[8]计算：LD50(g/kg)=log-1[Xm-i(∑P-0.5)]，LD50=22.44 g/kg。LD50的95%可信限为19.756～25.485g/kg。按照毒理学对药物毒性的分级标准[9-10]，LD50＞10000mg/kg即属于无毒性物质，因此复方中药制剂“归芪饮”口服液安全无毒。（3）动物在给药前与给药后第l周及第2周称量小鼠体质量，见表3。由表可知，各给药组小鼠体质量增加与对照组无明显差异(P＞0.05)。说明中药复方制剂“归芪饮”对小鼠体重无明显影响。

表2 小鼠急性毒性正式试验结果 (g/kg、只、%)

3 讨论

通过小鼠口服(灌胃)急性毒性试验研究，试验中给小鼠灌服“归芪饮”口服液的剂量达到12.98g/kg，小鼠死亡率为0，小鼠的死亡率随着给药剂量的增大而增大。按照毒理学对药物毒性评价标准[9,10]，当LD50大于10000mg/kg时，即表明该药无毒，而本实验口服液LD50为22.44g/kg。远大于10g/kg，说明复方中药制剂“归芪饮”对小鼠安全、无毒。并且通过测定在各给药剂量下小鼠体重，说明“归芪饮”对小鼠体重的增长无明显影响。

通过小鼠急性毒性试验和最大耐受量试验研究，表明复方中药制剂“归芪饮”安全无毒，客观评价了复方中药制剂“归芪饮”的安全性，为“归芪饮”的研发及在临床上的安全应用提供了参考依据。