绝经后女性血浆骨代谢相关差异蛋白表达的研究*

★ 郑雪峰吴铅淡 林燕萍

(福建中医药大学针灸学院 福州 350122)

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是以全身骨量减少，伴骨组织显微结构改变，致使骨脆性增高及骨折患病风险增加的一种全身性骨病。为常见的老年慢性疾病之一，尤其好发于绝经后女性。绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是指因卵巢功能衰竭引发、多种原因引起的单位体积骨组织中骨量减少，而骨矿物质和基质比不变的代谢性骨病。其发病机制与卵巢合成的激素降低有关，其与增龄性骨质疏松不同的是，松质骨的变化显著，常见脊椎骨折及腕部骨折[1]。目前本症已在世界常见病多发病中居第七位，现在患病人数已超过2亿，每年住院费用高达250亿美元，绝经后骨质疏松症及其并发症已然成为严峻的社会健康问题[2]。本研究基于课题组前期研究的基础上，拟采用具有高通量、高灵敏度蛋白检测的悬液芯片技术，分析不同骨量的自然绝经后妇女血浆中ACTH、DKK-1、FGF-23、IL-1β、IL-6、Insulin、Leptin、OPG、BGP、OPN、PTH、SOST、TNF-a等骨代谢指标的表达，分析并初步筛选出与骨代谢密切相关的关键细胞因子，为进一步探索防治绝经后骨质疏松症提供有力的循证医学证据。

1 资料

1.1 基本资料 全部研究对象共150例，均来源于2015年9月1日—2016年10月31日期间福建中医药大学附属省泉州市正骨医院就诊的泉州地区常住汉族妇女PMOP患者150例，年龄45～65岁，绝经年限均在1年以上，签署自愿加入临床研究。研究对象在性别、年龄、病程等方面经统计学分析差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准 参照1994年世界卫生组织(WHO)的骨质疏松症诊断标准，参考《中国人骨质疏松症建议诊断标准(第二稿)》[3]建议，基于双能X线骨密度仪(DEXA)测定值的骨质疏松症分级诊断标准执行。

1)症状：疼痛、脊柱变形、脆性骨折；

2)骨密度：双能X线吸收法(DEXA)测定值

T-score≥-lSD正常-2．5SD

1.3 纳入标准 1)符合诊断标准；2)年龄45～65岁，籍贯为泉州地区，居住≥10年的自然绝经后汉族女性，绝经年限≥1年；3)自愿加入该临床研究者，并签署知情同意书。

1.4 排除标准 1)不符合骨质疏松症的诊断标准者；2)年龄在45岁以下或65岁以上或自然绝经不足1年的女性；3)长期服用其他有关治疗药物，不能立即停用者；4)治疗前三个月内服用治疗PMOP中药、西药的病例；5)过敏体质者、支气管哮喘病史、晚期畸形、残疾者；6)有内分泌疾病、代谢性疾病或肿瘤，如甲亢、糖尿病、多发性骨髓瘤、骨科制动等引起的继发性骨质疏松等；7)合并有心脑血管、肝、肾和造血系统等严重疾病及精神病患者；8)难以沟通，不配合者。

2 研究方法

2.1 骨密度测定方法 150例自然绝经后妇女采用双能X线骨密度仪(DEXA)检测正位腰椎(L2-L4)骨密度。为消除体位和生理解剖对测量真实值的影响，嘱患者仰卧，身体上下、左右范围不能超出规定范围，掌心向下，两小腿抬高，下置立方体泡沫垫，使股骨与扫描床垂直，胫腓骨与扫描床平行。记录腰椎正位BMD、BMC及腰椎最低T值。根据受试对象前期的骨密度检测结果及调查问卷的情况，经受试者同意签署知情同意书后，予以免费检测。

2.2 病例分组 将2015年09月01日至2016年10月31日期间福建中医药大学附属省泉州市正骨医院就诊的泉州地区常住汉族妇女PMOP患者150例，年龄45～65岁，绝经年限均在1年以上，经腰椎(L2-L4)骨密度检测后，根据上述骨质疏松症分级诊断标准将上述病例分组如下：

①骨量正常组(T-score<-l.0 SD)；

②骨量减少组(-2.5 SD

③轻度骨质疏松组(-3.0 SD

④中度骨质疏松组(-3.5 SD

⑤重度骨质疏松组(T-score≦-3.5 SD或T-score≧-2.5 SD伴一处或多处骨折)。

2.3 悬液芯片检测血浆骨代谢蛋白差异

2.3.1 血浆样本采集 所有研究对象空腹抽取外周肘静脉全血5 mL置于EDTA抗凝管中，1000×g离心15 min，取上层血浆，-20℃贮存、备用。

2.3.2 悬液芯片检测 采用液相芯片分析系统(Bio-Plex悬液芯片系统检测仪，美国Bio-Rad公司)测定血浆标本中的13个骨代谢细胞因子：ACTH、DKK-1、FGF-23、IL-1β、IL-6、Insulin、Leptin、OPG、BGP、OPN、PTH、SOST、TNF-a。具体操作严格按照说明书进行。

2.4 统计学分析 实验数据采用SPSS16.0版统计软件进行分析、处理，结果用±S表示。组间比较采用两样本t检验；多组间比较使用单因素方差分析；相关性分析采用Pearson相关分析。P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有非常显著性差异。

3 实验结果

3.1 不同骨量组自然绝经后妇女血浆骨代谢蛋白比较 由表1可见，与骨量正常组相比，骨量减少组及不同程度骨质疏松组各组中DKK-1、IL-6、BGP、ACTH、IL-1β、OPN、SOST、TNF-a含量增加，OPG、Leptin、FGF-23、Insulin含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；PTH无统计学差异(P>0.05)。

3.2 骨密度与骨代谢蛋白的相关性分析 表2中显示骨密度与各血中骨代谢蛋白的相关性分析的r值、P值。由表可见DKK-1、IL-6、OPN、BGP、OPG、Leptin、FGF-23、Insulin与骨密度的相关性有统计学意义(P<0.05)，其中各组中随着骨密度的降低，DKK-1、IL-6、OPN 、BGP水平呈现逐渐上升趋势，OPG、Leptin、FGF-23、Insulin水平呈现逐渐下降趋势。

表1 不同骨量组自然绝经后妇女血浆骨代谢蛋白比较(pg/ml)

注 a:与骨量正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；b:与骨量减少组相比，◇P<0.05，◇◇P<0.01；c:与轻度骨质疏松症组相比，☆P<0.05，☆☆P<0.01；d:与中度骨质疏松症组相比，◆P<0.05，◆◆P<0.01。

项目rpACTH-0．8160．093DKK-1-0．8850．046IL-6-0．8910．044Insulin 0．9340．021Leptin 0．8820．048TNF-a-0．8060．090OPG 0．9160．007BGP-0．9460．008OPN-0．9330．013PTH-0．0580．933FGF-23 0．9420．017

4 讨论

PMOP目前的主要诊断依据是骨密度检测，尽管骨密度是反映骨质疏松轻重程度、预测骨折危险性的重要依据，同时也是评价骨量最有说服力的指标之一，但是骨密度检测具有以下缺点:无法反应整个机体的骨变化情况，骨密度精度误差约1%～5%，低于1%的变化难以被测定出来，不适合短期随访检测；用来监控药物治疗有明显的统计学意义至少需1年[4-5]。在骨质疏松早期，骨生化指标的改变较骨密度的改变出现早而明显。因此，骨代谢生化指标检测也逐渐用于临床骨质疏松症的诊断分型、预测骨折风险以及抗骨质疏松治疗疗效评价，并且在骨质疏松发病机制研究及流行病学研究方面具有重要临床意义。但是，传统的骨代谢标志物，如血钙、血磷、血清ALP等，都存在特异性差、敏感性低、干扰因素多等缺点。近年来一些特异性的骨代谢生化指标由于具有及时、灵敏、特异性等优点，可以早期反映出骨的转换水平，通过观察这些特异性骨代谢指标的变化，有利于发现骨折的高危人群，达到预测骨折发生的风险性，可进一步了解某治疗方法或药物对PMOP患者的早期疗效，对PMOP的诊治及治疗方案的调整起指导作用[6]。研究发现，一些骨代谢的生化指标与骨重建过程密切相关，BGP是骨基质中最主要的非胶原蛋白成分，主要由成骨细胞合成，骨形成和骨吸收均可释放BGP。因此，血浆中BGP浓度不仅与骨形成活跃程度有关，还反映了骨重建的整体水平。瘦素(Leptin)可通过与中枢和外周的受体结合从而对骨代谢进行调节，在外周Leptin能直接刺激成骨细胞分化[7]。骨保护素(OPG)是1997年由Simonet发现的一种分泌型糖蛋白，在成骨细胞、骨髓间质细胞等多种细胞均有表达，血浆OPG水平与年龄密切相关，骨吸收过量时，OPG代偿性分泌增加，绝经后女性OPG水平高于绝经前妇女[8]。DKK-1为成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间的耦联失衡导致机体骨高转换状态，为骨质疏松症骨量减少的重要原因。转化生长因子(TGF)是一类促进细胞生长与分化的重要调节因子，能刺激骨髓成骨祖细胞增殖分化能力；刺激成骨细胞基因的合成与表达，增强成骨细胞骨形成作用[9]。在本研究中，结果显示随着骨密度的降低，DKK-1、IL-6、OPN、BGP水平呈现逐渐上升趋势，OPG、Leptin、FGF-23、Insulin水平呈现逐渐下降趋势。提示DKK-1、IL-6、OPN、BGP、OPG、Leptin、FGF-23、Insulin可作为评价绝经后女性骨质疏松严重程度的检测指标，

为进一步探索防治绝经后骨质疏松症提供有力的循证医学证据。

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