分子诊断技术在乳品酵母菌数检测中的研究进展

常江，李畅，赵柯，关玉婷，孟宪梅，胡盼，孙宇，宿甲子，李岩松，柳增善

（1.吉林工商学院粮油食品深加工吉林省高校重点实验室，长春1305071；2.人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林大学人兽共患病研究所，吉林大学动物医学学院，长春130062）

0 引 言

微生物污染导致的食源性疾病是食品安全中的最重要问题之一[1]。乳品营养丰富，微生物污染会导致短时间内污染严重超标，降低乳品品质并引起变质、胀袋等，其中酵母菌污染是引起发酵乳胀袋、变质的主要原因[2]。乳品中常见酵母菌包括马克斯克鲁维酵母菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母、热带假丝酵母等[3]，其酵母总数是评定食品污染程度的标志，具有重要的卫生学意义。

1 酵母菌的国标检测方法

平板计数法是酵母菌计数的国标检测方法。GB4789.15-2016[4]规定，样本均质后经10倍系列稀释加入含有氯霉素的土豆-葡萄糖-琼脂培养基或在孟加拉红固体培养基中进行平板培养，28℃培养5 d后菌落计数。传统的微生物检测方法虽操作容易、成本低廉，但检测周期长、程序复杂，不利于企业筛查，远远不能满足现代检测的需要[5]。因此，近年来国内外对酵母菌的检测方法进行了新的探索。

2 酵母菌的分子诊断技术

分子生物学检测方法是现代致病微生物检测的核心技术[6]。随着分子生物学的不断发展和应用，分子诊断技术成为酵母菌检测最重要的组成部分[3]，主要包括核酸扩增技术和分子免疫学技术两类。

2.1 核酸扩增技术

2.1.1 PCR方法

分子生物学检测方法是现代致病微生物检测的核心技术,尤以PCR技术为代表[6]。PCR是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，该方法具有快速、灵敏、特异性强等优点，且特异性扩增产物可以通过26S测序鉴定，在8 h内诊断乳品中酵母菌种类[7]。常规PCR对酵母菌的检测限为106CFU/m L，进行DNA纯化后检测限提升至103CFU/m L[8]，但国标法要求乳品中酵母菌的检出率仅为102CFU/m L[4]。为了提升PCR扩增灵敏度，很早就有人提出了用巢氏PCR代替普通PCR进行检测，该方法相比普通PCR大大提升检测灵敏度[9]，但由于需要在第二轮PCR时进行开盖操作，巢氏PCR在提升检测限的同时也增加了污染的机会，造成实际样本中的假阳性增加。

2.1.2 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（LAM P）是一种新型的核酸扩增技术，近年来主要用于细菌和病毒检测，对真菌的研究也有报道[10]。该方法对仪器设备要求低，仅需恒温扩增，具有反应速度快，灵敏度高，特异性好的优点，酵母菌最低检测限为103CFU/m L[11]。其结果可以通过琼脂糖凝胶电泳反映，粗略时可眼观观测。但由于LAM P的封闭系统较差，开盖后电泳检测极易产生“气溶胶”污染，因此造成假阳性是该方法的主要问题。LAM P-LFD方法在LAM P基础上结合横向流胶体金试纸条技术，对LAM P进行了改进。一方面省略了琼脂糖凝胶电泳检测步骤，另一方面减少样本污染。该方法提高了检测准确性，检测时长大约50min，灵敏度是普通PCR方法的100倍[12]，受到国内外广泛关注和认可。

2.1.3 荧光定量PCR

荧光定量PCR（Quantitative Real-tim e PCR）是一种通过荧光染料或特异性荧光探针对PCR产物进行标记跟踪，实时监测反应过程，并结合相应软件分析产物及模板的分子生物学技术[3]。与上世纪90年代的终点PCR法相比，实时荧光定量PCR具有特异性更好、灵敏度更高、线性关系好、定量准确等的优势，成为酵母菌检测的一大突破，是当前酵母检测中的最为普遍的检测方法[3]。实验研究发现，尽管果汁等食品中的酵母菌以及常见腐败细菌的检测结果多会受食品成分及种类的影响而发生不稳定改变[13]，但乳品中酵母菌的检测并未受到乳品成分的影响[14]。因此，乳品中酵母菌检测可以不依赖于DNA提取，这对用荧光定量PCR方法直接检测乳品中酵母菌数的准确性提供了重要依据。

人们根据酵母菌检测目的对其引物进行了深度分析与探索。目前主要包括真菌通用引物[13]、酵母菌通用引物[16]以及特定酵母菌引物[17]的PCR检测。Kurtzm an和R obm ett等对所有已知酵母菌株测序分析发现，26S rDNA D 1/D 2区存在中间变异较大但种间变异小于1%的1 600 bp片段，这一片段经分析验证最终被国际酵母分类学界所普遍接收[16]。因此，目前常用酵母菌检测引物多以此片段为模板。其中存在26S rDNA D 1/D 2真菌通用引物N L1/N L4[18]可以进行9种酵母菌及霉菌的通用检测，灵敏度103～108CFU/m L，(但引物存在二聚体，不适用酵母菌的准确定量；另酵母菌ITSI通用引物在26S rDNA D 1/D 2区设计，检测线最低可达2～22 CFU/m L[19]。除此之外，酵母菌通用引物也包括18S rDNA[20]特异性引物及酵母肌动蛋白基因[21]检测等，能检测101CFU/m L纯酵母菌。荧光定量PCR在检测过程中采用绝对定量方法，需要注意，操作过程容易出现质粒扩散而导致假阳性[22]，实验过程应保持通风并及时关闭管盖，最大程度降低假阳性。

2.1.4 PM A/EM A-qPCR

传统荧光定量PCR受限于无法区分细胞死活[23]。因此，即使酵母菌死亡，裸露的DNA也可以持续存在于环境中，使得荧光定量PCR的检测结果高估病原体浓度，导致实际样本检测结果不准确。

PM A/EM A是一种DNA嵌入染料，能够穿透死细胞的受损细胞膜，可以通过曝光结合细胞外暴露DNA及非存活细胞的DNA，并阻止DNA在随后的PCR反应中被扩增[24]。由于存在颗粒及抑制剂抑制PM A/EM A与DNA的交联作用，因此只有少部分文献[25]报道了使用PM A/EM A-qPCR进行乳品中酵母菌的检测。但实验研究表明，与qPCR相比，PM A/EM A-qPCR对酵母菌的检测结果与国标法结果相近且呈现高度的线性相关，检测结果达到国标法检测要求[3]，说明该方法确实可以通过优化达到筛选目的，是一种很有前景的酵母菌检测方法。

2.1.5 RT-qPCR

酵母菌rRNA的RT-qPCR于2006年首次被提出。该方法检测限为10 CFU/m L，检测限低，具有实时荧光定量PCR（qPCR）能够快速检测和定量酵母菌数而不需要培养的优势，且因为死细胞没有被量化而使结果更加准确[26]。因此该方法是一种对酵母进行快速、准确检测的技术，可以更准确的控制腐败风险[27]。为评估热致死处理的酵母菌RNA稳定性的影响，N uria H ierro等人通过热处理后肌动蛋白RNA和DNA实验比较发现，热处理10 min后的12 h，经热致死处理的酵母m RNA稳定性较差，可能导致样品量化过程中酵母菌含量被低估。但rRNA和rDNA均稳定存在，26S rRNA可能与细胞活力相关，从而产生限制其立即降解的能力。细胞生理状态不同可能存在定量过程中基因表达差异问题，但经实验分析，这种差异不显著[26]。因此，RT-qPCR方法是检测乳品中酵母菌数的可靠方法。

2.1.6 自动化平台

自动化分子平台的出现突破了PCR传统空间限制，实现了样本提取、扩增、检测一体式方案，有效避免PCR污染难题[28]。该技术具有超前的样品制备系统、独特的PCR反应系统和封闭的内部质控。一方面，具有操作方法简单、结果稳定、花费时间短，总时间仅需30min的优点；另一方面，该技术确保安全性，技术一体化大大降低检测人员与病原体的接触几率，保护检测人员安全[29]。目前常见的自动化平台有GeneXpert快速检测系统、Am pliPrepTM/COBASⓇTaqm an系统等，主要用于流行疾病监控和临床检测。尽管该技术存在成本较高、便携性较差的短板，但随着经济发展和研究进步，自动化平台的应用将更为广阔[30]。

2.2 分子免疫技术

2.2.1 流式细胞技术

流式细胞技术（FCM）是一种使用流式细胞仪对液相中悬浮细胞及微粒测量的自动化检测技术[31]。流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞进行多参数、快速的定量分析。通过荧光标记、富集并将微生物细胞注入流式细胞仪的石英流式细胞柱，确保单个微生物细胞经过激光激发柱，经仪器分析及计算机计算得出样本酵母菌数[32]。随着分子免疫学、细胞生物学及电子计算机技术的迅速发展，流式细胞技术成为一种对生物粒子进行结构、功能及作用检测的重要仪器技术[33]。伴随该方法对酵母菌检测的使用，具有可检测出单个活酵母细胞的巨大优势，相比其他方法检测限不够而引入的增菌等方法，减少了工作量并增加检测准确性[34]。该技术检测需90～100min，已用于水、饮料、牛奶及其他液态加工食品等多个行业。为防止阻塞进样通道，流式细胞技术的所有样本均需进行前处理[35]，且由于流式细胞仪设备昂贵，该方法目前还未能在企业检测中普及使用。

2.2.2 双抗夹心ELISA方法

双抗夹心ELISA方法是酵母检测的分子免疫学方法。该方法特异性好、灵敏度高，在细菌检测中广泛使用[36-37]，但由于酵母菌相对细菌而言菌体很大，包被、捕获及检测过程中极易造成损失，致使实际检测结果偏低，使用抗活酵母细胞的多克隆抗体的ELISA技术对乳制品中腐败酵母物种的检测和计数是有限的[20]。酵母菌的ELISA检测方法主要用于检测酵母菌体蛋白，建立方法稳定性良好，精确度高，特异性强，最低检测限可达到6.25 ng/m L，常用于大量样本的酵母残留检测[38]。

2.2.3 胶体金免疫层析法

免疫胶体金技术(Imm une colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体中的一种新型的免疫标记技术[39]。酵母菌抗原在随测试带移动时与胶粒的检测物——抗酵母菌抗体复合物相互作用，形成的复合体持续流向检测区域固定的特异性酵母菌抗体，形成一道蓝线，该蓝线反映了酵母菌检测线（T线）的阳性结果，胶粒与其他特异性抗体反应的质控线（C线）反映检测功能正常[40]。该方法与国标培养法相比，敏感度为86%，特异度为94%，精确度为90%，检测时间在20 min以内，是临床诊断中一个重大的进步，对于特定分类酵母菌的检测有重要的参考价值。

3 结 论

微生物污染是食品安全中最重要的问题之一，是评价食品安全性的重要指标[41]。酵母菌污染是引起发酵乳胀袋、变质的主要原因，酵母菌数是评定食品污染程度的标志。国标法对于乳品中酵母菌的检测操作繁琐、耗时长，远远不能满足现代检测的需求。

分子诊断技术主要包括核酸扩增技术和分子免疫学技术两类。这些检测方法与平板计数法相比，具备灵敏度强、准确性高、操作简便等优点，可以为乳品中酵母菌检测提供更及时、有效的检测结果，是目前酵母菌检测的核心技术。其中荧光定量PCR及其改进技术具有高灵敏度、准确性、稳定性的优势，且乳品环境不会干扰扩增结果，是企业首选的检测方法。此外，对于酵母菌的检测方法一方面倾向于方便、快捷、人性化，因此胶体金试纸条与各类检测方法的联合使用受到广泛关注；另一方面，尽管以流式细胞技术为代表的新型检测方法存在成本较高的问题有待进一步解决，但随着科技水平的进步，这些新的分子生物诊断技术检测结果更加精准，功能更加多样，将在食品行业、公共卫生领域具有更为广阔的应用前景。