宏基因组学在乳及乳制品应用中的研究进展

胡婕，剧柠

(宁夏大学农学院，银川750021)

0 引 言

宏基因组(m etagenom e)[1]，指的是环境中所有微生物遗传物质的总和。宏基因组学(m etagenomics)[2]则是通过收集环境样品并提取样品中的优质DNA来构建宏基因组文库，通过高通量测序，对测序结果进行数据分析来研究样品中微生物的一种方法。宏基因组学解决了实验室条件下大量微生物难以培养或不可培养的难题，缩短了实验时间，具有高效性、准确性等特点。

目前，科研工作者常使用二代测序[3]和三代测序的高通量测序技术[4]来完成微生物宏基因组学的研究。二代测序主要是指Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，H iseq技术以及ABI公司的Solid技术。三代测序以H elicos公司的Helicos Genetic Analysis技术、PacBio公司的SM RT技术和O xford N anopore公司的纳米孔单分子技术代表。宏基因组学技术应用于乳品行业，为研究乳及乳制品中微生物的多样性和群落演替情况，发挥着重要作用。

1 干 酪

干酪是指在乳中(也可用脱脂乳或稀奶油等)加入适量的乳酸菌发酵剂和凝乳酶，使乳蛋白质凝固后，排除乳清，将凝块压成所需形状而制成的产品[6]。国内学者近年来运用宏基因组学技术对少数民族传统自然发酵干酪中的微生物进行研究，对其菌群多样性进行了挖掘。呼斯楞[7]从哈萨克斯坦的阿拉木图市和江布尔州两个地区采集了6份由当地牧民通过自然发酵制成的传统干酪，采用宏基因组学研究方法中的SM RT三代测序技术和传统分离鉴定技术对样品干酪中的细菌多样性进行分析。研究结果表明：宏基因组学技术中得到传统干酪中的细菌分属14个门的94个属144个种或亚种；其优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes 92.46%)，优势菌属为乳酸杆菌属(Lactobacillus 42.12%)，优势菌种分别为乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis 28.93%)和瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus26.43%)；弥补了传统方法仅分离得到了瑞士乳杆菌的失误，从而可快速、准确地反映出微生物的群落特征，全面客观地分析样品中微生物的多样性。焦晶凯，莫蓓红[8]使用Illumina MiSeq二代测序技术，对来自内蒙古呼伦贝尔哈吉、陈巴尔虎旗、东乌珠尔以及西乌珠尔4个地区，由当地牧民经过自然发酵而制成的不同干酪样品中的微生物多样性进行统计同时对不同样品间物种差异进行详尽分析。研究结果表明：4个干酪样品共分离出了432个菌属，主要包括乳酸杆菌属、醋酸杆菌属(Acetobacter)和乳酸球菌属(Lactococcus)；相比较土壤、海洋等样品，干酪的微生物丰度曲线较窄，干酪中的菌种较为单一，而丰度曲线的斜率较大，4个干酪样品中存在着优势菌种，且通过菌落组成分析可知4个干酪样品的优势菌分别为乳酸杆菌、乳酸球菌和醋酸菌；PCo A分析可知，地域的差异对4个干酪样品的微生物菌群分布组成有较大影响。

国外对干酪及干酪制品的食用更为普遍，对干酪的研究更早，也更为深入和广泛。A lexandre Ceugniez[9]等人为研究法国Tomm e d'O rchies干酪中微生物的多样性组成，采用宏基因组学中的Illumina二代测序技术，对真菌的5.8S rDNA的ITS2域进行测序。结果表明，Tomm e d'O rchies干酪中含有耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)和白地霉(Galactomyces geotrichum)；该干酪中还发现了一些少见的微生物如：葡萄牙棒孢杆菌(C lavispora lusitaniae)、单胞酿酒酵母(Kazachstania unispora)和芽枝霉菌(C ladosporium cladosporioides)；同时，宏基因组结果也显示了克鲁维酵母属(K luyveromyces)和德巴利氏酵母属(Debaryomyces)的存在。A lm eida[10]等人为降低成本且适用于宏基因组分析，采用illumina二代测序技术对从干酪制品中分离出的分属67个属137个种的142株细菌进行了测序。通过测序，重建了117个细菌的基因组草图，建立了一个基因组参考目录，包括从公共数据库中分离出的克鲁维菌属(K luyvera)、黄球菌属(Luteococcus)和嗜盐乳酸菌属(Marinilactibacillus)。为了证明这一新建基因组参考目录的价值，分析了两种涂抹干酪和一种蓝纹干酪表面的微生物成分，得出这些干酪中的微生物很大一部分是由新建基因组参考目录得到的，这有助于对干酪特性进行研究。除对干酪中的微生物群落多样性展开研究外，学者对干酪生产过程中的微生物群落变化也展开了深入研究。A lessandra Dalm asso[11]等人采用Illumina二代测序技术对意大利Plaisentif半硬质干酪的生产进行了跟踪研究。结果发现在干酪的生乳期、凝乳期微生物尤其是细菌多样性较高，变形菌门和厚壁菌门含量最高；干酪成熟前期、成熟后期微生物多样性较低，主要为厚壁菌门中的乳酸菌属和链球菌属(Streptococcus)，且多为乳酸菌。干酪制作的4个时期，均存在变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门、拟杆菌门(Bacteriodetes)、不动杆菌门(acinetobacter)。A lejandro[12]等人利用R oche公司的454二代测序技术对墨西哥Poro干酪的生产进行了跟踪研究，通过高通量测序研究其微生物多样性。结果发现，生乳期，微生物的细菌多样性最高，包括球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属、乳酸菌属和水栖菌属；乳清期、凝乳期和干酪期的微生物多样性较低，主要包括链球菌属和乳酸菌属，且凝乳后，丰度最高的是嗜热链球菌和德氏乳酸杆菌。一些细菌，如葡萄球菌属(Staphylococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、溶杆菌属(Lysobacter)、乳酸球菌属和肠球菌属(Enterococcus)等则会偶有出现。近年来，学者将宏基因组技术与其他技术相结合，深入研究干酪一些特性的形成机制。Wolfe等人[13]采用宏基因组学技术研究了3种不同表面形态共137种干酪的表面微生物群落结构，从中分离培养出细菌和真菌共24株。该研究首次同时对如此多种类干酪的进行微生物研究，揭示出部分微生物的某些特殊功能与干酪的表面特性形成相关，假交替单胞菌(Pseudoalteromonas spp.)可产生甲硫氨酸γ-裂解酶；通过原位和体外重构研究，重现了干酪的发酵过程，确定物种间的相互作用和微生物的群落演替，提供用一种简单模型来研究干酪发酵过程中真菌和细菌间的作用机制[14]。A lejandra Escobar-Zepeda[15]等人通过Illumina二代测序技术对墨西哥手工Cotija干酪中的优势细菌和丰度进行究，同时通过高通量测序技术来研究干酪中微生物的代谢能力。经研究分析发现，Cotija干酪中的优势细菌主要为乳酸菌、明串珠菌属(T richococcus)和魏斯氏菌属(W eisteria)；在细菌和古生菌的31种属中均发现有超过500种非主要的微生物种属，并且干酪中未发现沙门氏菌(Salmonella)、单胞菌(Monoucleosis)、布鲁氏菌(Brucella)及分支杆菌(M ycobacterium)等致病菌的存在；此外，Cotija干酪中的微生物组也具有合成多种风味化合物的代谢能力，主要涉及的是支链氨基酸和游离脂肪酸的新陈代谢，以及一些与细菌产生和免疫有关的基因也相继被发现。基因组学技术和代谢组学技术的共同应用不仅可以研究Cotija干酪中微生物的多样性和微生物群落演替规律，也可以研究作为各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物(MW＜1000)。

2 酸乳

酸乳是普通牛乳经过巴氏杀菌，冷却到一定温度后，接种乳酸菌，再经过发酵而赋予特殊风味的一种乳制品[16]，它是众多的发酵乳制品中最原始、产量最大的品种。目前我国学者对酸乳的研究工作主要从酸乳中微生物的多样性开展。智楠楠[17]等人采用宏基因组学中的Illuminna二代测序技术来分析9种市售酸奶中的微生物多样性。通过测序发现样品酸奶中的主要微生物是厚壁菌门，占酸奶中微生物总数的99.6%。而厚壁菌门中主要为链球菌属(87.1%)、乳杆菌属(10.3%)、乳球菌属(0.3%)，并且9种酸奶中有3种酸奶同时含有链球菌属和乳杆菌属，其余6种酸奶中几乎为链球菌属(＞97%)，表明不同酸奶菌种的同质化程度较高且链球菌属在酸奶中为优势菌属。张敏[18]等人采用llumina二代测序技术对新疆克州和塔城地区的酸牛奶、酸驼奶、酸马奶以及自然发酵酸奶中细菌群落组成和微生物多样性进行研究。研究结果表明：酸奶样品中的细菌Shannon-W iener指数较高；不同动物酸乳的菌落组成存在较大差异，说明不同动物的体内所含有的微生物种类不同，但4种酸乳样品中的菌群都以厚壁菌门为主；在属水平上，酸牛奶、酸驼奶和酸马奶中都是以乳杆菌属为主。

开菲尔(kefir)是以牛乳或羊乳为原料，经数十种乳酸菌、酵母菌以及醋酸菌发酵而来复合型发酵酸乳[19]。开菲尔中含有嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lacto-bacillus casei)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paraca-sei)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等多种益生菌，具有较好的益生功能[20]。高洁[21]等人对灭菌的蒙牛脱脂乳中接入开菲尔粒，采用宏基因组学的Illumina二代测序技术研究其中的微生物多样性。样品中的微生物被鉴定到8个属，分别为乳球菌属(74.13%)，醋酸菌属(Acetobacter 9.86%)，乳杆菌属(Lactobacillus 5.01%)，链 球 菌 属 (4.87%)，希 瓦 氏 菌 属 (Shewanella 1.27%)，明串珠菌属 (Leuconostoc 0.49%)，假单胞菌属(Pseudomonas0.37%)和不动杆菌属(Acinetobacter 0.04%)，且乳酸菌属为优势菌群；此外，样品中有0.06%的序列没有被鉴定出结果，但随着进一步的实验，这些尚未被发现的细菌是否具有安全性也可作为研究的一个重点方向。U fuk N albantoglu[22]等人采用R oche公司的454焦磷酸二代测序技术对两种开菲尔乳中的微生物多样性进行研究。研究结果表明：这两种开菲尔中的微生物菌落表现出高度的一致性，其中乳酸菌属是最为丰富的菌属，其含量分别为99.42%和99.79%，并且两种乳酸菌属中的开菲尔基质乳杆菌(Lactobacillus kefir)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)和瑞士乳杆菌三种菌种之和分别占乳酸菌属的97.63%和98.74%。杨晓娟[23]对开菲尔豆酸奶直投式发酵剂进行研究。使用开菲尔母液分别接种纯豆奶、纯豆奶与纯牛奶比为1：1、纯牛奶的3种原料，采用宏基因组学技术中的测序技术对3种发酵酸奶中的微生物进行测序。研究结果表明：在属水平上，3种酸奶中的主要微生物依次为乳球菌属、醋酸杆菌属、乳酸杆菌属和链球菌属；此外，3种酸奶中乳酸杆菌属存在显著性差异(P＜0.05)，混合豆乳发酵酸奶中乳杆菌属为6.34±0.02%，约为纯牛奶发酵酸奶的2.5倍，纯豆奶发酵酸奶的4.5倍，乳球菌属、醋酸杆菌属和链球菌属差异不显著(P＞0.05)。

3 原料乳

原料乳通常指的就是生鲜乳[24]，即从动物乳房挤出的未经过任何处理的生奶。张敏[18]等人采用llumina二代测序技术对新疆克州和塔城地区的牛奶、驼奶、马奶、羊奶4种原料乳中细菌群落组成和微生物多样性进行研究。结果表明：原奶样品中的细菌Shannon-W iener指数较低；不同动物的原料乳的菌落组成存在较大差异，说明不同动物的体内所含有的微生物种类有所不同，但4种原料乳样品中的菌群都以变形菌门为主；在属水平上，牛奶中的微生物群落是以假单胞菌属(Pseudomonas)为主，驼奶中的微生物群落主要为埃希菌属-志贺菌属(Escherichia-Shigella)，马奶中的微生物群落主要为明串珠菌属，羊奶中微生物群落中国的优势菌属为乳球菌属。此外，实验还发现原料乳中的环境污染菌和条件致病菌的丰度都较高，说明这7种乳样受到不同程度的污染，提出为提高乳品品质，应从乳品生产、加工、运输、贮藏等各个方面严格把关。对于冷藏中的原料乳，Conor J.Doyle[25]等人采用Illumina二代测序技术对原料乳中的微生物进行宏基因组学研究，通过研究冷藏温度为(2℃、4℃和6℃)和存储时间(96 h)对散装乳罐原料乳(BTM)的影响来评估季节性、贮藏时间和贮藏温度对混合原料奶中微生物组成的影响。研究结果表明：温度和时间对原料乳中微生物变化影响小，泌乳阶段对原料乳中微生物变化影响大。Raquel Lo[26]采用高通量测序研究了较低的CO2压力下原料乳的菌群多样性，通过454焦磷酸二代测序技术和illumina二代测序技术的比较，说明对于同一样品两者结果具有高度的相似性，最终实验结果表明较低的CO2压力结合4℃冷藏可将原料乳保质期延长至少7天。李玲[27]等人从广西的3个牛场中采集到了高质量的水牛原料乳，采用Illumina二代测序技术对原料乳中的微生物群落及其动态变化进行研究。研究结果显示原料乳中含有大量微生物，且在储存过程中，原料乳中微生物种群数量也随时间推移而发生变化，其中乳酸菌属和链球菌属在24 h之内占据主要优势，当存储时间达72 h以上时，假单胞菌和不动杆菌属为优势菌属，占原料乳整个微生物群落数的60%以上。这项研究表明：水牛原料乳在挤出后应当立即冷藏，并在运输过程中及时检测其中有无类芽孢杆菌的产生。

4 其他乳制品及乳饮料

4.1 巴氏杀菌乳

巴氏杀菌乳(pasteurized milk)，简称巴氏乳或市乳，是由新鲜牛乳为原料，经过巴氏杀菌法处理后直接供给消费者饮用的商品乳[28]。巴氏牛乳的处理方法比较温和，较好地保存了牛乳的营养与天然风味，在杀灭牛乳中的致病菌的同时，几乎不会对牛乳原本的色、香、味等产生多大的副作用，最大限度地保留牛乳原有的特质与风味[29-30]。李玲[27]等人从广西的3个牛场中采集到了高质量的水牛原料乳，采用Illumina二代测序技术对巴氏杀菌乳中的微生物群落及其动态变化进行研究。研究结果为：巴氏杀菌乳中含有种类繁多的微生物，在储存过程中，巴氏杀菌乳中微生物种群的数量也随着时间推移而发生变化，优势菌群由乳酸菌属(7 d)变为类芽孢杆菌(21 d)。这项研究表明：巴氏杀菌法应当在收集完原料乳的24 d内进行，因为此时原料乳中嗜冷菌数相对较低。

4.2 UHT乳

UHT[31]（U ltra H igh Tem perature treated）是采用135～150℃，4～10 s，进行超高温瞬时灭菌（以完全破坏其中可以生长的微生物和芽孢），然后在无菌状态下进行包装，以最大限度地减少牛乳在物理、化学以及感官上变化的一种鲜奶处理的灭菌工艺。由于UHT乳[32]的超高温瞬时灭菌可以杀死乳中的大量微生物，使得乳中微生物种类和数量都大大减少，因此国内外学者将宏基因组学应用于UHT乳上的研究较少，主要是利用宏基因组学技术来检测UHT中的少量微生物，从而保持乳品品质。黄卫强[33]等人选用国内两种品牌的UHT乳为研究对象，以Illumina二代测序对UHT乳样中微生物宏基因组DNA的16S rRNA基因v1-v3可变区扩增产物进行序列测定，根据序列的相似性进行OTU s划分。结果表明：两种品牌的UHT乳样中的微生物主要为厚壁菌门，拟杆菌门，变形菌门，以及放线菌门(Actinobacteria)；而在属水平的微生物群落结构显示，两个UHT乳样中的微生物多样性丰度存在差异，但是差异并不显著。宏基因组学技术的应用，使得UHT乳中微生物被快速准确检测，节约人力、物力，从而能够提高乳品的品质，提升产品效益。

5 展 望

食物中的微生物群落通常被认为是低丰度的，因此，相比其他领域，宏基因组学在乳及乳制品方面甚至食品领域研究较少。然而，随着测序技术及生物信息学技术的发展，近年来宏基因组学越来越多的被用于乳及乳制品中，研究微生物群落结构及其演替规律，深度挖掘出传统培养方法无法获得的微生物信息。此外，宏基因组学结合蛋白质组学、代谢组学技术等其他组学技术，研究乳及乳制品中微生物与营养、代谢组份及环境条件变化的关系，深刻揭示乳及乳制品品质变化机制将成为未来的研究趋势。