蒿鳖养阴软坚方通过激活Nrf2/NQO1信号通路抑制肝纤维化发生

刘 悦，李杉杉，唐诗慧，方步武

（天津医科大学药理学系,天津300070）

肝纤维化是当肝脏受到反复的炎症或慢性致病因素刺激时所进行的肝脏代偿性修复反应，是所有慢性肝病发展成肝硬化乃至肝癌过程中所共同经历的病理阶段，以原本处于静止状态的肝星状细胞（HSCs）被激活，细胞外基质（ECM）合成和降解失衡，ECM过度沉积于肝内为主要特征[1]。Frideman等[2-3]指出，肝脏在肝纤维化阶段尚有逆转的可能性，但如不加以控制和治疗，极有可能发展成肝硬化甚至是肝癌。现阶段西医对于肝纤维化的治疗途径主要包括：（1）病因治疗，从根本上减少与造成肝损伤的慢性致病因素接触；（2）刺激正常肝细胞的再生和修复；（3）有效控制HSCs增殖，并且促进其凋亡；（4）促进ECM的分解，使得其合成和降解重新达到平衡。中医对肝纤维化的研究起源于对活血化瘀的研究，属“徵积”范畴，中药用于防治肝纤维化的药物大致可以分为活血化瘀类、疏肝理气类和清热解毒类[4]。本课题组在过往的研究中已经证实蒿鳖养阴软坚方（HBYYRJ）对于治疗免疫性肝纤维化、四氯化碳复合因素所致肝纤维化、血吸虫肝纤维化模型以及酒精性肝纤维化均有显著的治疗作用，保护肝脏免受酒精、化学毒物和自身代谢性疾病的损伤[5-9]。本研究主要从蒿鳖养阴软坚方抗由CCl4诱导的肝脏过氧化损伤着手，首先建立CCl4复合因素所致的大鼠肝纤维化模型，给予蒿鳖养阴软坚方不同治疗剂量的治疗，测定肝组织内羟脯氨酸（Hyp）含量来评估大鼠肝脏肝纤维化程度，测定肝组织内Nrf2和NQO1的表达水平和分布情况来评估蒿鳖养阴软坚方抗肝纤维化发生的作用与抗氧化应激通路Nrf2/NQO1之间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 SPF级健康Wistar大鼠共60只，体质量100~130 g，雌雄各半，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物饲养室温20~24℃，实验前正常饲养动物1周以适应环境。

1.1.2 蒿鳖养阴软坚方 由青蒿、鳖甲、虎杖等9味药材组成，称取一定质量该复方，量取6倍体积蒸馏水，先将鳖甲煮至微沸状态2 h后，将其余药材倒入，浸泡2 h，微沸状态煮沸1 h后，将所得药液滤至烧杯，量取等体积60%乙醇，微沸状态提取2次，每次2 h，将两次醇提所得药液和上述水提所得药液混匀，悬蒸至所称药材的体积，即可得到生药浓度为1 mg/mL的蒿鳖养阴软坚方药液，密封，4℃保存备用。1.1.3 试剂 四氯化碳、高氯酸、枸橼酸、枸橼酸钠、对二甲氨基苯甲醛、氯胺T和异丙醇（天津市光复精细化工厂）；秋水仙碱（Sigma公司）；兔抗Nrf2抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；鼠抗NQO1抗体（美国Santa Cruz公司）；PV-9001兔超敏二步法检测试剂盒（中杉金桥生物公司）；PV-9002鼠超敏二步法检测试剂盒（中杉金桥生物公司）；DAB染色液（上海博士德生物技术有限公司）；SDS、甘氨酸和丙烯酰胺均为天津市鼎国生物科技有限公司产品；免疫组化一抗稀释液、RIPA裂解液、蛋白印记一抗稀释液、蛋白印记二抗稀释液、蛋白印记一抗二抗去除液（强碱性）、PMSF、EeyoEcl Plus试剂盒、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒A盒、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒B盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）和DTT均为碧云天生物科技有限公司产品。

1.1.4 仪器 FA1004型电子天平（上海HANG PING精密仪器有限公司）；B600型低速自动平衡离心机（河北安新县白洋离心机厂）；OLYMPUS CK-40显微镜（上海赖氏电子科技有限公司）；整合分光光度计（UV-200）；WD-9405A型脱色摇床（北京市六一仪器厂沃德生物医学仪器分公司）；4360型鼓风干燥烘箱（Thermo Scientific）；XMTE-8222型水浴锅（上海惊鸿仪器）；PHS-3C型pH计（上海雷磁仪器厂）；LS-B50L立式压力蒸汽灭菌锅（上海华线医用核子仪器有限公司）；HQ-60-II型漩涡混合器（杭州瑞成仪器股份有限公司）；680型酶标仪、垂直电泳槽和小型电泳仪均为BIO-RAD公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及设计 将购入的60只Wistar按照随机区组分组的方法随机分为正常组、模型组、秋水仙碱组、蒿鳖养阴软坚方高剂量组（8.2 g·kg-1）、中剂量组（2.59 g·kg-1）和低剂量（0.82 g·kg-1）组共 6组。正常饲养1周后，开始建立CCl4复合因素所致的大鼠肝纤维化模型，除正常组外，其余大鼠均第1次皮下注射40%CCl4花生油的容量为5 mL·kg-1，从第2次至建立模型完毕，给药剂量均为3 mL·kg-1；实验前两周，除正常组大鼠给予正常鼠粮饲养外，其余大鼠均进食自制高脂高胆固醇饲料，第3周至造模结束期间，自制鼠粮将不再添加猪油；给药组大鼠隔日灌胃给予30%乙醇，每只灌胃容量为1 mL；蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量组和秋水仙碱组则每日分别灌胃给予蒿鳖养阴软坚方药液和秋水仙碱，模型共建立6周。

1.2.2 标本采集 模型周期结束后，所有大鼠均再持续饲养1周，用0.5 mL·kg-1腹腔注射25%乌拉坦生理盐水溶液麻醉后，方可采集标本，腹腔静脉取血后，取肝组织分别保存于Ep管中放置于-80℃超低温保存箱中冻存，以及盛有固定液和脱水液的西林瓶中，脱水液需要每日更换，直至换够6次。

1.2.3 指标测定

1.2.3.1 比色法测定肝组织内Hyp的含量：用研钵将脱水后的肝组织研磨成粉，称取一定量的粉末于西林瓶中，放置于105℃烤箱内高温烘烤至衡重，称取烘烤后的粉末40mg于安瓿瓶中，吸入8mL6mmol/L盐酸，酒精喷灯封口，重新放入105℃烤箱内水解18 h后，过滤，各样本吸取50 μL于离心管内，放入60℃烘干，依次加入1.2 mL 50%异丙醇和0.2 mL 0.56%氯胺T溶液反应10 min后，加入1 mL ER液，50℃水浴90 min后，用紫外分光光度计测定各样本的吸光度值，制作标准曲线，按照公式Hyp含量（μg/mg）=(检测管吸光度值-空白管吸光度值)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准管Hyp浓度×稀释倍数，计算各样本Hyp含量。

1.2.3.2 检测肝组织内Nrf2和NQO1的分布情况：将切片置于玻片架，60℃烘烤2 h，依次放入二甲苯、无水乙醇、95%、85%和70%乙醇中脱蜡后，转入3%过氧化氢甲醇溶液中灭活15 min，浸泡于pH=6的醋酸-柠檬酸缓冲液中，126℃修复5 min，待液体自然放凉后，正常羊血清封闭30 min后，孵育一抗Nrf2（1∶100）和 NQO1（1∶80），4 ℃过夜，次日，弃去一抗，分别滴加试剂I和试剂II，并37℃孵育30 min，DAB显色后，苏木素染色，中性树胶封片，晾干，使用荧光显微镜采图进行分析。

1．2．3．3 检测肝组织内 Nrf2 和 NQO1 表达水平：使用匀浆器将冻存的肝组织制备成匀浆，按照PIRA∶PMSF=99∶1 的比例，冰上裂解 1 h 后，以 2 000×g的转速，4℃离心10 min后，收集上清，按照BCA蛋白浓度检测盒说明书步骤进行蛋白定量，计算上样量，蛋白变性后即可上样，30%聚丙烯酰胺凝胶电泳，全湿式电转法将蛋白从凝胶转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉水平摇床上封闭2 h后，将各条带放入相应的杂交袋中孵育一抗Nrf2（1∶400）和NQO1(1∶100)，4℃摇床过夜，次日，将条带取出，TBST充分漂洗3次，5 min/次，重新放入杂交袋内孵育二抗抗鼠β-actin（1∶1 000）和抗兔β-actin（1∶1 000），常温水平摇床孵育2 h后，TBST充分震荡洗涤4～5次，5 min/次，按照EeyoEcl Plus试剂盒说明书，曝光。使用Quantity One凝胶软件分析系统分析各蛋白条带的光密度值。

1．3 统计学分析 所有统计分析均采用SPSS 16．0软件进行处理，计量资料均以±s表示，样本间均数的比较采用单因素方差分析（one-way，ANOVA）的方法进行比较。

2 结果

2．1 蒿鳖养阴软坚方对四氯化碳复合因素所致大鼠肝纤维化肝组织内Hyp含量的影响 与正常组相比，模型组的Hyp含量显著升高（P＜0．05），说明CCl4复合因素所致大鼠肝纤维化建模成功；与模型组相比，给药组的 Hyp 含量明显降低（P＜0．05）（表 1）。

表1 蒿鳖养阴软坚方对四氯化碳复合因素所致大鼠肝纤维化肝组织内Hyp含量的影响Tab 1 Effect of HBYYRJ on the content of Hyp of CCl4-induced rats hepatics fibrosis （±s）

表1 蒿鳖养阴软坚方对四氯化碳复合因素所致大鼠肝纤维化肝组织内Hyp含量的影响Tab 1 Effect of HBYYRJ on the content of Hyp of CCl4-induced rats hepatics fibrosis （±s）

与正常组相比，*P＜0．05；与模型组相比；#P＜0．05；与 HBYYRJ高剂量相比，△P＜0．05；与 HBYYRJ中剂量组相比，□P＜0．05

分组正常组模型组秋水仙碱组HBYYRJ 8．2 g·kg-1 HBYYRJ 2．59 g·kg-1 HBYYRJ 0．82 g·kg-1含量of Hyp/（μg/mg）0．210±0．012#△□0．368±0．013*△□0．280±0．047*#0．272±0．027*#0．298±0．021*#0．322±0．051*#△

2．2 蒿鳖养阴软坚方对四氯化碳复合因素所致大鼠肝纤维化各组大鼠肝组织内Nrf2和NQO1分布的影响 Nrf2的分布情况见图1，与正常组和模型组相比，秋水仙碱组以及蒿鳖养阴软坚方各剂量组Nrf2核转位显著增加，且高剂量组和中剂量组Nrf2核转位显著高于低剂量组。NQO1的分布情况见图2，各组NQO1的分布与Nrf2的核转位比较结果基本保持一致。

图1 各组大鼠肝组织内Nrf2分布情况的检测结果Flg 1 The distribution of Nrf2 in the liver tissue of each group

图2 各组大鼠肝组织内NQO1分布情况的检测结果Flg 2 The distribution of NQO1 in the liver tissue of each group

2．3 蒿鳖养阴软坚方对四氯化碳复合因素所致大鼠肝纤维化各组大鼠肝组织内Nrf2和NQO1表达水平的影响 各组大鼠肝内NQO1的表达水平见图3，Nrf2的表达水平见图4。实验结果显示：与模型组相比，HBYYRJ高中低3个剂量组NQO1和Nrf2 的表达水平明显升高（P＜0．05），与高剂量组相比，中剂量组大鼠肝组织内Nrf2和NQO1表达水平并没有统计学意义，但低剂量组肝组织内的Nrf2和NQO1 表达水平明显降低（P＜0．05）。

图3 各组大鼠肝组织中NQO1表达水平的检测结果Fig 3 The expression level of NQO1 in liver tissue of each group

图4 各组大鼠肝组织中Nrf2表达水平的检测结果Fig 4 The expression level of Nrf2 in liver tissue of each group

3 讨论

HSCs作为正常肝组织非实质细胞的组成部分，正常生理状态下，处于静息状态存在于狄氏间隙中，但当肝脏受到各种慢性致病因素如酒精、脂肪蓄积、化学毒物、胆汁淤积或某些代谢性疾病长期损伤时，会刺激库弗细胞和窦内皮细胞等分泌大量的炎症因子、趋化因子和ROS等，从而激活HSCs，被活化的HSCs开始逐渐转化为具有弹性的肌成纤维细胞（MFB），并通过自分泌和旁分泌的途径不断合成大量的ECM，ECM合成和降解失衡，在肝组织内过度蓄积，就直接导致了肝纤维化的发生[10]。胶原蛋白是ECM的主要成分，而羟脯氨酸，作为人体的一种非必须氨基酸，也是胶原蛋白的主要成分，所以肝组织中Hyp的含量即可直接反映胶原蛋白的含量，从而客观反映肝组织内ECM的沉积状况和肝纤维化程度。研究结果表明，与正常组相比，模型组 Hyp 含量大大提高（P＜0．05），说明此次建立四氯化碳复合因素所致的大鼠肝纤维化模型成功；与模型组相比，蒿鳖养阴软坚方各给药组Hyp的含量显著降低（P＜0．05），说明蒿鳖养阴软坚方可以有效缓解肝组织内ECM的沉积，从而抑制肝纤维化发生。

四氯化碳作为最经典、最常见的广泛用于诱导动物或者细胞建立急性实验性肝纤维化模型的化学毒性物质[11]，其诱导原理为：CCl4进入细胞后，细胞色素P450首先将其代谢为三氯甲基自由基（CCl3`），CCl3·与氧反应，生成三氯甲基过氧化自由基（CCl3OO·），刺激库弗细胞生成大量的ROS和细胞因子，激活HSCs,导致氧化应激损伤和脂质过氧化反应,生成的最终产物丙二醛等，会损伤细胞膜的流动性和完整性，从而损伤肝组织结构和功能，进而诱发肝纤维化[12-13]。本研究就肝纤维化形成过程中发生的氧化应激反应展开探讨，着重研究Nrf2/ARE信号通路在蒿鳖养阴软坚方发挥抗肝纤维化发生中的作用。正常生理状态下，Nrf2与Kea1蛋白藕联存在于胞浆中，遵循正常的合成和降解的过程，但是当细胞受到氧化应激或者亲电试剂刺激时，Nrf2与Keap1解偶联，转位进入细胞核，与胞核内的抗氧化反应元件ARE结合，从而启动该通路下游抗氧化酶和II相解毒酶的转录和表达，从而发挥抗氧化应激。由此可见，在Nrf2/ARE信号通路保护细胞免受过氧化损伤的过程中，Nrf2与Keap1解偶联，进入细胞核是该过程的关键性环节，所以Nrf2与细胞核的结合数量，就可以体现该通路的表达程度，Nrf2与细胞核结合的越多，说明该通路信号表达越强，相应地，其下游转录的抗氧化酶和II相解毒酶表达水平也就越高。受到该通路调控表达的酶有许多，比如血红素加氧合酶-1(HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)以及本实验重点研究的NAD(P)H:醌氧化还原酶I(NQO1)[14]。NQO1是一种溶解于细胞质，普遍存在的同型二聚体黄素酶，属于II相解毒酶范畴，可以直接催化醌类化合物失去2个电子从而被还原为水合醌类（氢醌），大多数氢醌均可与谷胱甘肽或者葡萄糖醛酸形成共轭稳定地存在于细胞内或者直接被排除体外，区别于其他氧化还原酶的是，该催化过程中没有单电子还原产物、半醌以及自由基等氧化产物的形成，从而保护细胞免受一系列过氧化损伤[15]。

本研究结果显示，就Nrf2的核转位以及NQO1的表达而言，模型组明显低于正常组，而正常组又明显低于蒿鳖养阴软坚方各给药剂量组，该结果与上述实验猜想一致，蒿鳖养阴软坚方可以有效地上调Nrf2/NQO1通路的表达，进而促进Nrf2的核转位，上调NQO1的表达水平，促进醌类化合物还原为氢醌，形成稳定的共轭结构或者直接排除体外，从而缓解由CCl4所诱导的氧化应激反应，保护细胞免受过氧化损伤。蒿鳖养阴软坚方抑制由CCl4复合因素诱导的大鼠肝纤维化发生的作用机制是多方面的，本实验主要从抗氧化应激的层面逐步展开探讨，证实了蒿鳖养阴软坚方可以有效地上调抗氧化应激通路Nrf2/NQO1的表达，促进Nrf2的核转位，上调其下游抗氧化酶的表达，同时有效降低肝组织内Hyp的含量，缓解ECM的过度沉积，达到抵抗CCl4复合因素诱导的大鼠肝纤维化发生的作用，为临床上提供了新的治疗肝纤维化疾病的思路，为研究开发抗肝纤维的新药提供了新的依据和治疗靶点。

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