口服巯基供体改善动脉粥样硬化兔硝酸酯耐药的实验观察

陈良，蒋锦琪，冯辉

硝酸酯类药物是治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的经典用药，并在多种心血管疾病的急救和常规治疗中发挥举足轻重的作用。然而，持续用药24～72 h以上或短间隙频繁用药则很容易产生硝酸酯耐药，影响长期药效。为此，各种动物模型或临床试验探索硝酸酯耐药的机制和防治方法，国外研究显示鸟苷酸环化酶激活物BAY 60-2770及松弛素可以通过增加血管一氧化氮（NO）水平，减轻氧化应激反应来改善硝酸酯耐药[1,2]。N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为一种巯基供给体，可通过抗氧化发挥心脏、肾脏、呼吸系统及神经系统的保护作用。NAC的心脏保护作用主要表现在心肌缺血/再灌注方面，其在改善硝酸酯耐药效应方面鲜有报道。本研究采用5-单硝酸异山梨醇酯（ISMN）建立动脉粥样硬化兔的硝酸酯耐药模型，探讨其耐药机制并观察口服巯基供体NAC对硝酸酯耐药的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 单硝酸异山梨醇酯缓释胶囊（H20031224，优时比制药有限公司），乙酰半胱氨酸颗粒（H20000472，海南赞邦制药有限公司），盐酸赛拉嗪注射液（吉林省敦化市圣达动物药品有限公司），硝酸甘油注射液（H11020291，北京益民药业有限公司）。抗超氧及超氧阴离子自由基（·O2-）测试盒、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒、NO试剂盒、微量总巯基（T-SH）测试盒均购于南京建成生物工程研究所，内皮素-1（ET-1）放射免疫分析药盒（北京北方生物技术研究所）。Fogarty动脉取血栓导管（YZB/USA 4009-77-2004，美国爱德华生命科学世界贸易公司）。MPA 2000离体实验系统、ALC-M恒温组织浴槽由上海奥尔科特生物科技有限公司生产。K-H溶液配方：NaCl 130 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、MgSO41.17 mmol/L、KH2PO4 1.18 mmol/L、NaHCO314.9 mmol/L、CaCl21.6 mmol/L、Glucose 5.5 mmol/L、EDTA 0.026 mmol/L。

1.2 实验动物及分组 40只雄性新西兰大白兔（上海杰思捷实验动物有限公司提供），体质量（2500 ±200）g。动物的饲养和实验过程遵循国家《实验动物管理条例》和《实验动物质量管理办法》。并随机分为正常组、模型组（AS组）、硝酸酯组（ISMN组）、硝酸酯耐药组（NT组）和用药组（NT+NAC组），各8只。模型组以及药物干预组均建立腹主动脉粥样硬化模型。

1.3 腹主动脉粥样硬化模型建立[3]实验兔麻醉

后，取仰卧位，右下肢备皮，常规消毒铺巾，解剖暴露右膝隐动脉，纵向切开管壁，向近端插入3F Fogarty动脉取血栓导管约20～25 cm至腹主动脉上端，向球囊内注入生理盐水0.1～0.15 ml充盈球囊至适当阻力，沿动脉来回牵拉球囊约5～8 cm，反复3次以保证充分剥脱损伤动脉内皮，拔除导管，结扎隐动脉，缝合伤口。术毕每日肌注庆大霉素8万单位共3 d，并饲以高脂饲料（0.5%胆固醇+5%猪油+15%蛋黄粉+79.5%普通饲料）共8周。通过病理组织学证实兔腹主动脉粥样硬化模型建立情况。

1.4 给药方案 高脂饲料饲养8周后，ISMN组灌胃给予ISMN 25 mg，1/24 h；NT组灌胃ISMN 25 mg，1/12 h；NT+NAC组则同时灌胃ISMN 25 mg和NAC 100 mg，1/12 h；AS组和正常组（普通饲料）不用药。给药期间继续高脂饮食。

1.5 取材与检测 连续给药7 d后，5组实验兔均以相同方法取材和检测。切取腹主动脉，浸于K-H溶液中，而后每5 mm剪为数段。取1段行常规石蜡包埋、切片、HE染色并中性树胶封片，于显微镜下判断动脉粥样硬化形成情况；另取1段用以血管环舒张反应检测；其余各段分别通过相应试剂盒行血管组织T-SH（微量酶标法）、·O2-（化学比色法）、SOD（黄嘌呤氧化酶法）、MDA（硫代巴比妥酸法）、NO2-（亚硝酸盐，硝酸还原酶法）、ET-1（双抗体夹心ABC-ELISA法）测定，其操作严格遵循试剂盒说明书。

1.6 血管环舒张反应检测 将所取血管环一端与肌力传感器相连，悬挂于装有10 ml K-H溶液的ALC-M恒温（37 ℃）组织浴槽中，另一端加以2 g负荷，连续通入含95%O2及5%CO2的混合气体，平衡2 h，使血管平滑肌处于最稳定长度。平衡后通过MPA 2000离体实验系统记录血管环静息张力及收缩舒张曲线，然后加入10-5mol/L的苯肾上腺素，当血管收缩至最大张力时记录数值，曲线平坦稳定后依次加入10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L的硝酸甘油（NTG），轻拌搅匀，记录相应浓度梯度的张力值，计算舒张幅度百分比=（最大张力值-梯度张力值）/（最大张力值-静息张力值）×100%。

1.7 统计学方法 采用SAS 8.1软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔腹主动脉粥样硬化建模结果 取材前所有实验兔均状态良好，无腹泻、感染等并发症。对动脉粥样硬化实验兔的腹主动脉进行肉眼观察，血管内膜均出现不规则隆起的灰黄色斑块、斑点或长短不一的条纹。各建模组HE染色后，于光学显微镜下观察均可见内膜不同程度的增厚，大量泡沫细胞、平滑肌细胞和脂质沉积。提示实验兔的腹主动脉粥样硬化模型均制备成功，图1。

2.2 血管环舒张反应结果 各组血管环的舒张幅度均随NTG浓度的增加而递增。当NTG为10-9mol/L时，正常组、AS组、ISMN组及NT+NAC组之间血管舒张幅度比较，差异无统计学意义（P均＞0.05）；NT组则显著低于其余四组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。当NTG浓度为10-8～10-4mol/L时，与正常组比较，AS组、ISMN组、NT组以及NT+NAC组血管舒张幅度均降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）；NT组血管舒张幅度则显著低于其余四组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。当NTG浓度达到10-4mol/L时，正常组、AS组、ISMN组和NT+NAC组的最大舒张幅度分别为（98.91±1.99）%、（79.12±6.28）%、（81.17±7.75）%和（81.92±9.59）%，NT组仅为（58.87±8.09）%，表1。

2.3 各组生化指标测定结果 T-SH含量由高至低依次为正常组、AS组、NT+NAC组、ISMN组及NT组，各组间比较差异均有统计学意义（P均＜0.05）。·O2-、MDA、ET-1和NO2-含量：正常组、AS组、NT+NAC组、ISMN组、NT组呈升高趋势，除正常组与AS组外，其余各组间比较差异均有统计学意义（P均＜0.05）。NT组SOD含量低于正常组，且NT+NAC组SOD含量高于NT组，差异均有统计学意义（P均＜0.05），表2。

3 讨论

硝酸酯药物常用于治疗冠状动脉粥样硬化心肌缺血、充血性心力衰竭、高血压等心血管疾病，其主要机制是作为一种非内皮依赖性外源性NO供体[4,5]。低浓度的NO与肌膜上可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）血红素结构域的Fe2+结合形成复合物，使sGC处于轻度激活状态，而高浓度的NO可进一步与sGC非血红素结合位点的半胱氨酸-SH结合而完全激活sGC[6,7]。激活的sGC可使环磷酸鸟苷（cGMP）生成增加，从而抑制细胞外Ca2+内流、增加细胞内Ca2+排出、加速肌浆网对Ca2+摄取，最终降低细胞内Ca2+浓度而舒张血管。当持续应用硝酸酯类药物后血管壁-SH逐渐减少或被亚硝酰化，导致硝酸酯源性NO生成减少或sGC活性下降而产生耐药；此外，持续应用硝酸酯还可以使RAAS激活、血管紧张素Ⅱ水平升高产生大量·O2-。·O2-不但可以与NO反应形成过氧亚硝基阴离子，削弱NO对sGC的活化作用，还能使sGC非血红素结合位点的-SH被氧化而失活，导致cGMP生成减少、血管舒张减弱[8]。这是硝酸酯耐药发生的重要环节，影响硝酸酯药效。

NAC的化学结构中含有活性-SH，不仅能为硝酸酯生物转化提供活性-SH，而且能有效清除体内的活性氧成分、保护酶的活性。本研究通过在动脉粥样硬化兔中持续给予长效硝酸酯类药物分析NAC抗硝酸酯耐药的效果及机制。血管舒张反应测定发现，NT组在不同浓度NTG作用下的舒张反应均明显弱于其他组，提示短间隙应用ISMN不仅导致了血管耐药性的产生，而且对NTG产生了交叉耐药。当加用NAC后，NT+NAC组的血管舒张反应较NT组显著改善，提示NAC可有效改善ISMN的耐药效果，维持血管舒张活性。

血管组织生化检测结果发现，T-SH含量由高至低依次为正常组、AS组、NT+NAC组、ISMN组以及NT组。·O2-、MDA、ET-1和NO2-含量：正常组、AS组、NT+NAC组、ISMN组、NT组呈升高趋势；AS组、正常组、NT+NAC组、ISMN组、NT组的SOD含量呈降低趋势。提示ISMN可使-SH消耗增加，且随用药间隙的缩短消耗增多，加用NAC后可使组织T-SH水平显著升高。口服NAC可能具有清除活性氧物质、恢复SOD活性的作用。

表1 各组于不同浓度NTG时的血管舒张幅度（n=8，%）

表2 各组腹主动脉生化指标测定值比较（n=8）

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