复杂色谱信号自动解析中的化学计量学方法

杜国荣 ，董怡青，李 跑*

(1.湖南农业大学 食品科学技术学院，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；2.上海烟草集团有限责任公司技术中心 北京工作站，北京 101121)

色谱及其联用技术，如气相色谱-质谱(GC-MS)、高效液相色谱/二极管阵列检测器(HPLC/DAD)以及高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)等得到了飞速发展，在复杂环境、医药、生物样品分析中得到了广泛应用，并向高通量、简单、快速、灵敏、低成本的方向发展[1-3]。其中，自动化色谱分析是现阶段研究的重点和难点。自动化色谱分析研究主要通过采用自动化的进样方式、改进分离分析模式或仪器的硬件结构来实现快速和批量分析。一方面采取合理的样品前处理方法，以实现待测物与干扰物的分离，另一方面采取先进的分离手段，以实现待测组分之间的完全分离。这些手段在硬件方面为自动化检测奠定了基础。此外，自动化的色谱解析以及组分的定性和定量分析必须有可靠的数据采集和处理软件作保证。然而，在自动化色谱分析的软件方面存在较多问题：一方面对于仪器得到的复杂二维或更高维数据的分析相较于一维数据的分析并未得到同等的重视，即使采用了先进的自动化进样技术和分离手段，对于复杂数据的分析仍需大量人力来实现；另一方面，由于分析对象的复杂性，低含量组分的信号易受到其它干扰组分的影响而导致无法实现准确的定性定量分析[4]。

化学计量学在背景噪声的自动化扣除或组分信息的自动化提取领域取得了卓越的成效，为复杂色谱信号自动化解析提供了新思路。针对复杂色谱信号的解析问题，科学家建立了多种化学计量学方法，如化学因子分析[5-6]、多元曲线分辨-交替最小二乘法[7]、小波变换[8]、免疫算法[9-10]等。但现有的化学计量学方法并不能完全有效地实现复杂体系色谱信号的自动化解析。其主要原因在于：①对操作者的各类解析方法熟悉度要求较高。大部分化学计量学方法参数较多，需人工干预才能达到较好的解析目的，提高了对操作者的经验要求；②对于干扰严重的色谱信号，大多数化学计量学方法解析效率较低、时间长，甚至不能有效实现信号的准确解析，因而不能满足复杂色谱信号的自动化解析需求。

图1 色谱数据自动化分析程序Fig.1 Flowchart of automated chromatographic data analysis

为此，自动化色谱解析算法成为科研工作者关心的重点，大量自动化解析算法被提出[11-50]。如图1所示，色谱数据自动化分析程序主要包括4部分：自动色谱峰识别(Automatic chromatographic peak detection,ACPD)、背景以及基线漂移校正(Background drift correction,BDC)、色谱谱峰漂移校正以及重叠色谱峰的解析[11-12]。本文对近年来发展的复杂色谱信号自动化解析中与这四部分相关的化学计量学方法原理与应用进行了总结与评述。

1 自动色谱峰识别研究新进展

色谱信号中组分的定性与定量分析的关键在于色谱峰的准确识别。色谱图中每个色谱峰对应一个组分，但由于仪器和环境因素的影响，谱图中常出现未能完全分离的重叠色谱峰以及不规则峰形，如前肩峰、后肩峰、拖尾峰甚至负峰等。这些不规则峰的出现加大了ACPD分析的难度。近年来针对一维以及二维色谱数据，国内外学者提出了许多适合于ACPD的新算法，已有研究主要集中在对导数法的改进以及发展基于质谱信号的ACPD算法两部分。

基于一维色谱信号的ACPD分析算法可分为两类：基于色谱峰基本物理特性而建立的ACPD算法和基于小波变化的ACPD算法。前者主要利用色谱信号的信噪比、色谱峰形状(高斯拟合)和一阶/二阶导数实现色谱峰的ACPD解析；后者主要基于色谱信号中各组分的信息在时域或频率域中存在的差别，采用小波分析将色谱信号分解从而提取各组分的色谱信息。在基于色谱峰基本物理特性的ACPD算法研究中，Boe[13]提出了一种改进的泊松模型方法——面积重现法。该方法直接从实验色谱信号中计算得到模型的参数且不改变谱峰的形状和大小，可用于快速识别色谱峰。但该方法采用同一峰形参数来拟合信号中的所有谱峰，从而忽略了组分间色谱峰的差异，易给解析结果造成较大偏差。Vivó-Truyols等[14]提出了一种基于高阶导数的ACPD方法，以一阶导数为基础确定组分的洗脱区域，而色谱峰的快速识别则采用二阶导数实现。但该方法依旧无法实现有效的ACPD分析，原因在于该方法需加入经验确定的阈值来实现噪声和组分信号的区分。为此，刘明明等[15]将原本的ACPD方法结合面积重现法，提出了全新的ACPD算法，较好地实现了复杂色谱如烟气谱图等的ACPD分析，且在一定的范围内能识别大量复杂谱峰中湮没的未知组分信息及其大致量。此外，由于色谱峰在平滑窗口中具有局部最大值，因此Fu等[16]基于多尺度高斯平滑建立了一种新型的ACPD方法，可以实现复杂色谱信号中组分信息的准确提取。对于基于小波变化的ACPD分析方法研究，Zhang等[17]通过充分利用小波空间的附加信息，提出了多尺度谱峰检测(Multi-scale peak detection,MSPD)的方法，并分别采用Python和Cython对算法进行了编写，结果表明该方法可以大大提高复杂色谱信号ACPD分析的准确性。然而以上基于一维色谱信号解析的方法在对复杂色谱信号进行ACPD分析时，大多不能直接检测两峰是否重叠，需用户设置某个参数加以判断。此外，这些方法的解析效率较低，无法实现大量数据的自动化分析。针对低信噪比的信号解析，这些算法大多不能得到正确的结果。

GC-MS是现阶段应用最多的色谱联用技术之一。相对于色谱信号的不稳定，质谱信号中不易出现基线和色谱峰漂移的影响，且存在已建立完善的标准质谱库，因此更适于ACPD分析。Miao等[18]基于目标因子分析(Target factor analysis,TFA)，建立了一种适合于GC-MS数据的ACPD方法。以标准质谱库中某一组分的质谱为目标因子，利用算法判断色谱信号中是否存在该组分信息，利用目标因子与该方法计算得到的质谱之间的相似性作为判断该组分是否存在的依据。所建立方法成功实现了蔬菜中农残等复杂GC-MS信号的ACPD分析。此外，本课题组[19]基于迭代目标转换因子分析(Iterative target transformation factor analysis,ITTFA)，提出了一种GC-MS的ACPD算法。该方法同样以标准质谱库中某一组分的质谱作为初始向量，沿着色谱洗脱时间采用ITTFA逐一检验，以迭代得到的质谱与质谱库中质谱的匹配度作为判断该物质是否存在的依据，从而确定复杂色谱信号中所包含的组分信息。利用所建立的方法，实现了河水样品中16种邻苯二甲酸酯类物质的ACPD分析。TFA和ITTFA均可用于识别色谱信号中是否存在目标组分信息，但不适用于共存组分较多的大数据矩阵的分析。因此，本课题组又提出了“移动窗口目标转换因子分析(Moving window target transformation factor analysis,MWTTFA)”方法[20]，沿GC-MS数据矩阵的保留时间方向逐步识别目标组分，不仅可用于判断目标组分是否存在，还可直接得到目标组分的洗脱时间区间。在解析结果中浓度为零的组分即为不存在的组分，而对于存在的组分则可以得到相应的色谱信息。所建立的方法在复杂农药混合物色谱信号ACPD分析中得到了成功应用。

2 背景以及基线漂移校正研究新进展

通过ACPD可以实现组分数以及待测组分洗脱时间的确定，但复杂色谱信号中背景以及基线漂移严重影响了后续的色谱自动化分析，需对其进行校正。近年来，越来越多的化学计量学方法被用于BDC分析。这些方法主要可分为三类。第一类是基于多项式拟合的方法，但简单的多项式拟合方法效率低，且解析结果的准确性受操作者经验的影响。改进型多项式拟合方法在解析结果的准确性和自动化程度上有所提高，但是遇到复杂的色谱信号解析时，这些方法依旧无法实现理想的BDC解析。第二类是基于小波变换的方法，由于背景和基线信号具有较低的频率，因此在小波空间上扣除较低频率的背景信息可以实现BDC分析。Liu等[21]提出了一种基于提升方案和最小均方算法的自适应小波变换并将该小波变换用于色谱信号的背景校正。先使用LMS算法生成自适应提升小波的滤波器，再使用提升方案计算信号的细节和近似系数，从而根据频率高低将信号分解成不同的部分。由于不同部分之间频率的差异，背景信号可以很容易地被识别和移除。此外，在背景移除的过程中，通过加入“回馈操作”来保证信号不会被“过扣除”。该方法的优势在于可以在不事先选择小波函数的情况下根据处理目的和信号本身的特点产生自适应的提升小波滤波器，从而省去了传统小波变换对信号进行分解时选择小波函数这一繁琐而复杂的工作，大大减少了工作量。该算法已成功用于农药混合物色谱信号的BDC分析，但该方法进行小波变换比较耗时，且需对特殊峰区间和重叠峰等进行特殊处理，算法参数多，因此较难实现自动化的BDC分析。第三类是基于惩罚最小二乘的BDC算法。在对较为复杂的色谱信号BDC处理时，这些算法无法正确识别谱峰位置，易导致最终结果中负值的产生。为了改进传统方法参数多和效率低的缺点，并实现自动BDC分析，Zhang等[22]提出了一种自适应迭代惩罚最小二乘(Adaptive iteratively reweighted penalized least squares,airPLS)方法，仅通过1个参数即可实现快速自动化的BDC分析。采用参数λ调节拟合背景平滑程度，采用迭代逐步削弱峰对背景拟合的影响，通过引入稀疏矩阵算法将其时间和空间复杂度变为线性，从而可用于更加复杂色谱数据的BDC分析。该方法已成为BDC分析中最常用的方法之一。Baek等[23]在airPLS方法基础上，基于广义Logistic函数，提出了非对称加权惩罚最小二乘(Asymmetrically reweighted penalized least squares,arPLS)方法。与airPLS的对比结果表明该方法提高了对于复杂色谱信号BDC分析的准确性。此外，Liu等[24-25]发现在数据平滑或基线校正时利用稀疏矩阵算法能使矩阵的运算速度大大提升，并通过结合双边指数平滑算法和分位数回归算法，采用迭代加权的策略，提出了选择性加权分位数回归算法和自动双边指数平滑算法。前者以处理数据的稳健性见长，而后者以处理数据的快速高效性突出。采用这两种方法均可以实现色谱信号快速准确的BDC分析。

此外，由于ACPD处理中往往需要对色谱信号进行BDC计算，对色谱的BDC处理也促进了ACPD分析。因此目前的研究通常将色谱数据自动化分析的前两个阶段(ACPD和BDC)联合解决。Yu等[11-12]提出了ACPD-BDC算法，可以实现从复杂色谱数据中自动提取组分信息并消除背景和基线的干扰；Fu等[26]提出了局部最小值稳健统计分析方法(Local minimum values-robust statistical analysis,LMV-RSA)，首先找到信号中的局部最小值，然后基于稳健统计方法采用迭代优化的方式去除属于组分信息的局部最小值，最后采用线性插值的方式扣除信号中的背景信号。该方法成功提取了GC和GC-MS信号中的色谱信息，如色谱峰的保留时间、峰面积、峰高以及起始位置。Torres-Lapasiód等[27-28]提出了一种新型的ACPD算法和去卷积方法，通过指定阈值的方式来区分信号与噪声，首先根据一阶导数对信号进行分区，再根据二阶导数实现对色谱峰的自动识别；针对GC-MS数据的分析，Brereton等[29-30]发展了一种针对大批量GC-MS数据的自动峰值检测和匹配的算法，在一定程度上解决了色谱数据自动化分析的问题。

3 谱峰漂移校正研究新进展

在实验操作中，仪器漂移、固定相分解、分析物互相反应等不可控因素，导致不同检测物中同一物质的色谱峰洗脱时间不同，给定性定量分析造成了一定的困难。谱峰漂移校正是将有差别的色谱中同一物质的谱峰校正至相等的矩阵列中。在谱峰漂移校正方面已提出了许多算法。

第一类是基于一维数据的优化算法，主要有动态规整、峰检测和进化算法等。但是对于复杂的色谱峰，如信号中不同组分信号强度的差别较大且重叠严重等，这些方法无法实现有效的谱峰漂移校正[31]。为此，Zhang等提出了alignDE(Alignment of chromatograms by differential evolution)算法[32]和多尺度谱峰对齐法(Multiscale peak alignment,MSPA)算法[33]。前者采用微分进化算法优化谱峰位置，从而实现谱峰漂移校正，而后者采用连续小波变换确定每个色谱峰的起始位置，将待测信号中的色谱峰按大小顺序依次进行谱峰漂移校正。Savorani等[34-35]开发了icoshift(Interval correlation optimised shifting)工具包，可以实现色谱信号的谱峰漂移校正。Li等[36]基于色谱中的共有峰实现谱峰漂移校正，提出了最长距离移动(Longest distance shifting,LDS)方法。与相关最优化规整(Correlation optimized warping,COW)和icoshift方法相比，该方法计算过程简单，可以实现较为复杂的色谱信号(如重叠峰等谱峰)漂移的校正。Christin等[37-38]将传统的一维优化函数转为多通道下函数优化，提出将组分侦测方法与变形方法相结合的色谱时间校正策略(Correlation optimized warping coupled to component detention algorithm,DTW-CODA)。Zheng等[39]基于多尺度高斯平滑，建立了自动时间漂移校正(Automatic time shift alignment,ATSA)方法。该方法包括ACPD-BDC、自适应的初步校正和精准校正3个部分。通过对复杂模拟数据以及实际数据的分析,ATSA处理后数据之间的相关性得到了显著提高，表明该方法可以实现复杂色谱数据的谱峰漂移校正。

第二类是基于二维数据的算法，现阶段具有代表性的方法有基于ITTFA[40]、秩最小化的时间漂移校正法(Rank minimization,RM)[41]及基于平行因子分析(Parallel factor analysis,PARAFAC)[42-43]等建立的谱峰漂移校正方法。其中，ITTFA策略不同于RM和PARAFAC策略，前者是先分解后对比，分解单样本得到其组分的色谱峰，对比同种组分的不同样本的谱峰位置差异，后者侧重于最小拟合残差的求取以实现谱峰漂移校正。因此ITTFA算法的准确性取决于算法对单样本的解析结果，而RM和PARAFAC方法基于谱峰漂移校正转换为寻找数据最佳拟合，并未构建与谱峰漂移直接相关的目标函数，因此这些方法在解析较为复杂的色谱数据时有可能存在一定的问题。为此，Yu等[31]提出基于样本间抽象子空间差异度(Abstract subspace difference,ASSD)的谱峰漂移校正方法。该方法的基本思想是色谱时间谱峰漂移可以在抽象子空间中反映出来，从而可以利用两样本间的抽象色谱子空间差异实现谱峰漂移的校正。此外，Zheng等[44-45]采用快速傅立叶交叉相关和质谱信息以实现谱峰漂移的校正。首先采用连续小波变换得到谱峰的洗脱区域和峰宽信息，利用快速傅立叶变换交叉相关计算得到每一段保留时间区域的候选移动点数；然后与参考峰对应的质谱进行匹配，确定每一段候选峰的最佳移动点数；最后对无信号区间进行线性插值和谱峰移动以实现最准确的谱峰漂移校正。该方法可用于联用仪器如GC-MS和LC-MS数据的谱峰漂移校正。此外，Zheng等[46]又利用色谱组分逐步流出的特性以及谱峰漂移的局部相似性进行谱峰漂移校正。通过加入移动窗口的方式，计算每个窗口交叉相关来估计待校准信号需移动的点数，可用于高通量色谱峰漂移的校正。

4 重叠色谱峰解析研究新进展

现已建立了各种重叠色谱峰解析的方法，大多算法都采用固定的“窗口”通过将原始数据分割成包含有色谱峰的小段数据，再利用算法实现对色谱峰的自动化检测。基于化学因子分析的窗口因子分析方法(Window factor analysis,WFA)是一种应用非常广泛的信号解析方法。WFA方法的关键是找到目标组分浓度分布的区域，这个连续的区域被称为目标组分的“窗口”。但在传统的WFA方法中，“窗口”的确定通过检查所有可能的“窗口”再加上合适的判据来实现，这种方式非常繁琐和费时。此外，复杂实际样品的信号常受到背景和谱峰重叠的干扰，使得“窗口”的确定尤为困难。这些问题限制了WFA方法在色谱信号自动化分析中的应用。为了解决这个问题，本课题组[5]发展了一种广义的“窗口”，提出了广义窗口因子分析算法(Generalized window factor analysis,GWFA)，用于实际复杂样品GC-MS信号的快速解析。该方法具有以下优势：“窗口”确定简单准确，因而避免了传统WFA方法中因“窗口”确定不准确时定量结果出现偏差的弊端；由于该方法基于质谱方向建立“窗口”，因而消除了色谱谱峰偏移所带来的影响；该方法不易受到信号中较大噪声的干扰。但是该算法需将色谱信号进行分段处理以缩小计算，因此无法完全实现对色谱信号的自动化分析。

实际样品复杂且基质干扰严重，利用GC-MS进行分析时谱峰重叠现象难以避免且信号较为复杂，给信号解析提出了极大的挑战。针对多组分重叠色谱信号的自动化解析问题，Shao等[19-20]提出了一种基于曲线拟合的免疫算法。通过实验或计量学提取得到标准信号，免疫算法已成功应用于混合样品重叠色谱信号的解析中。既往研究中建立的免疫算法通常只适用于少量组分构成的数据，计算之前必须将数据分段，以减小算法应用的难度，因而很难称为真正的自动高通量分析。而Wu等[47]结合独立成分分析、ITTFA和非负免疫算法，提出了一种基于多步筛选过程的真正的高通量分析计量学方法。首先，通过独立成分分析和ITTFA来提取重叠GC-MS信号中所有可能存在的质谱信息；然后以质谱之间的匹配率作为判断依据，对获得的质谱数据进行第二次筛选，排除重复信息；最后利用经过前两步筛选得到的质谱，通过非负免疫算法计算得到相应的色谱数据，通过计算信噪比，对得到的色谱信号进行最后一次筛选，最终将重叠GC-MS信号中所有存在的组分提取出来。以40种农药混合物的GC-MS信号进行验证，表明该方法可以一次性地将40种农药的质谱和色谱信息提取出来，实现了对重叠GC-MS信号的自动化高通量解析。此外，本课题组[20]结合MWTTFA和非负免疫算法，建立了一种高通量解析方法。利用MWTTFA检验复杂信号中存在的组分，确定目标组分的质谱信息和洗脱时间的区间，然后以得到的质谱信息作为后续计算的输入值，利用非负免疫算法解析得到相应的色谱信息。采用快速升温程序对17种和42种农药混合标准样品的GC-MS信号进行分析，利用所建立的方法可在10 min内得到全部组分的色谱和质谱信息，实现快速自动化分析。

近年来，随着各类新型高阶量分析仪器，如全二维液相色谱光二极管阵列联用仪、全二维液相色谱质谱联用仪的发展，获取包含大量化学信息的高维数据已变得较为容易，而传统的数据处理方法难以实现对复杂高维数据的自动分析。因此，研究者们基于PARAFAC算法建立了一系列的自动解析算法[48-50]。通过将原始数据分割成包含有色谱峰的小段数据，采用非常少的参数，利用PARAFAC算法即可实现对色谱峰的自动化检测。利用一台普通的笔记本计算机，采用默认的参数即可在10 min内实现包含有30种多环芳烃的复杂样品GC-MS信号的快速解析。此外，Yu等[31]结合ASSD 和交替三线性分解(Alternating trilinear decomposition,ATLD)算法,能够在干扰存在下准确校正出分析物的时间漂移并获得“二阶优势”。Wu等[51-54]将ATLD方法引入复杂HPLC/DAD和LC-MS信号的自动化解析中，采用“数学分离”对复杂的重叠数据进行解析。结果表明，即使在色谱峰严重重叠的情况下，利用该方法亦可以实现对复杂体系中特定多组分的同时定性定量分析，快速解析得到目标分析物的色谱、光谱、质谱和浓度信息，具有独特的“二阶或高阶优势”。

5 前景与展望

色谱数据自动化分析程序的四个部分中，目前的研究大多仅集中解决了其中一个或两个部分，且主要集中在前两个阶段，即ACPD和BDC，而对后两个阶段——色谱谱峰漂移校正以及重叠色谱峰解析的研究较少。因此，这些方法在一定程度上解决了色谱数据自动化分析的问题，但往往需将原始数据分割成包含有色谱峰的小段数据，不适合大规模数据的自动化分析；同时，对于复杂的食品样品分析，往往不能得到正确的解析结果。此外，新型高阶量分析仪器如全二维液相色谱光二极管阵列联用仪可以提供四维或更高阶的色谱数据。这些数据包含更丰富的分析信息，能避免背景干扰和基体效应，且不易受外界条件的影响，进而提高了预测精度。如何进一步快速有效地提取这些新型仪器提供的复杂色谱信号的信息，并以化学计量学为指导，通过自动化及计算机技术以实现现代分析仪器的智能化功能将成为今后的重点发展方向。

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