金标记羟胺放大化学发光检测赭曲霉毒素A

李 素，肖义陂，武 乐，姜萌萌，刘 杰，严喜鸾*

(1.南昌大学 资源环境与化工学院，江西 南昌 330031；2.南昌市洪都中医院，江西 南昌 330008；3.江西省肿瘤医院，江西 南昌 330029；4.南昌大学 药学院，江西 南昌 330031)

纳米金(Gold nanoparticles，AuNPs)是指粒径为纳米级别的金颗粒，常被用作免疫学检测标记物或探针，是近年来纳米材料研究热点之一[1]。它具有小尺寸效应、表面效应以及独特的电化学和光学性质，在临床诊断治疗以及药物和生物小分子检测方面被广泛应用[2-3]。

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是由曲霉属和青霉属产生的真菌毒素，稳定存在于小麦、玉米、可可豆等农作物中[4-5]。在人血清中，OTA具有很长的半衰期，不易被降解。此外，OTA还可产生各种严重的毒性，例如胚胎毒性、致畸性、致癌性、免疫毒性、肝毒性等[6]，已被国际癌症研究机构(IARC)确定为ⅡB类致癌物[7]。目前，欧盟对烤咖啡中OTA的限量标准为5 ng/mL[8]。我国国家标准GB2761-2011中,规定谷物和豆类及其制品中OTA的限量标准为5 μg/kg[9]。

常用的OTA检测方法主要有高效液相色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱-荧光检测法和液相色谱-串联质谱[10-13]。另外，基于OTA免疫抗体分子作为识别元件的免疫检测方法，近年来也有不少报道[14-15]。但色谱法对样品的纯度及检测器要求比较高，设备价格昂贵，前处理过程比较繁琐，检测周期长。本文所采用的金标记羟胺放大化学发光检测法具有设备价廉、操作简单、线性范围广、灵敏度高、分析时间短等优点[16]。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

BPCL微弱发光测量仪(中国科学院生物物理研究所)；HZ-9211KB恒温振荡器(太仓市科教器材厂)；磁性分离器(日本Toyobo公司)；Eppendorf Research系列移液器(德国Eppendorf公司)；优普超纯水制造系统(四川优普超纯科技有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；Nano-S马尔文纳米粒度仪(美国Malvern公司)；紫外可见分光光度计(北京普析分析仪器公司)。

羧基磁性微球(直径1.5 μm，20.3 mg/mL)购于德国Polysciences公司；1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)购于美国Sigma公司；赭曲霉毒素A(OTA)标准品购于上海国药集团化学试剂有限公司；鲁米诺购于百灵威化学技术有限公司；链霉亲和素购于北京科跃中楷生物技术有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、咪唑、三羟甲基胺基甲烷(Tris)购于上海爱紫特生物科技有限公司；氯金酸购于上海化学试剂有限公司；碳酸钾、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、浓盐酸、柠檬酸三钠、吐温20(Tween20)购于西陇化工股份有限公司；以上试剂除Tween20为化学纯外，其他均为分析纯。实验样品为雪花啤酒；实验用水为超纯水。

核酸序列均购于上海生工生物有限公司，序列如下：捕获探针：5’-CACCCACACCCIATCAAAAAAAAAA-NH2-3’；OTA 适体：5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’；生物素化报告序列(biotin-reporter DNA)：5’-CACCCACACCCGATC-biotin-3’。

1.2 实验方法

1.2.1链霉亲和素纳米金的制备[17]取100 mL 0.01% 氯金酸于三口烧瓶中，置于集热式磁力加热搅拌器中搅拌加热至沸腾，迅速加入4 mL 2%柠檬酸三钠，沸腾10 min后自然冷却，用0.1 mol/L K2CO3溶液调至pH 6.8～7.0，再加入10 mL 0.022 mg/mL链霉亲和素，反应10 min，加入500 μL 1% PVP稳定剂，6 000 r/min离心1 h，沉淀再用1% PVP洗涤3次，最后用0.1 mol/L PBS(137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4·12H2O，2 mmol/L KH2PO4，pH 7.4)定容至10 mL，于4 ℃保存待用。

1.2.2基于磁性微球载体与适体技术的金纳米生物传感器制备取40 μg羧基磁性微球于1.5 mL离心管中，置于磁性分离器进行磁性分离，移去上清液，用100 μL 0.1 mol/L的咪唑缓冲液(pH 6.0)洗涤3次；加入100 μL含EDC的0.1 mol/L咪唑缓冲液，使微球重新悬浮，37 ℃下活化20 min；再加入20 pmol氨基修饰的捕获探针，37 ℃下振荡孵育1 h；磁性分离并用100 μL PBST(137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4·12H2O，2 mmol/L KH2PO4，0.05% Tween20，pH 7.4)洗涤3次；10% PVP进行封闭反应，37 ℃下振荡孵育1 h；磁性分离并使用100 μL PBST洗涤3次；加入10 pmol OTA适配体，37 ℃下振荡孵育1 h；磁性分离并洗涤3次；再加入20 pmol生物素修饰的报告序列，37 ℃下振荡孵育1 h；磁性分离并洗涤3次；加入100 μL由BB缓冲液(10 mmol/L Tris，0.12 mol/L NaCl，0.005 mol/L KCl，0.02 mol/L CaCl2，pH 8.5)配制的不同浓度OTA，37 ℃下振荡孵育1 h，磁性分离洗涤；OTA 竞争下部分生物素报告序列，继续加入与生物素特异性结合的50 μL 1% PVP的3倍稀释的链霉亲和素纳米金(SA-AuNPs)，37 ℃下振荡孵育0.5 h，磁性分离并洗涤3次；待测。

1.2.3羟胺放大检测将100 μL 0.05 mmol/L HAuCl4和100 μL 0.05 mmol/L NH2OH 加入到磁性微球复合物中并置于37 ℃恒温振荡反应0.5 h，然后加入50 μL 4 ℃水溴饱和液，常温反应10 min后，60 ℃反应20 min；取50 μL反应液，再加入100 μL 1.0 μmol/L鲁米诺的NaOH溶液迅速混合后，立即放入化学发光仪中测定。实验以化学发光信号最高值作为最终信号值。

2 结果与讨论

2.1 实验原理

首先设计一条与捕获序列和报告序列均能杂交，且包含OTA适体的序列，然后利用金纳米与鲁米诺化学发光原理，以羧基磁性微球作为固定和分离载体,通过捕获序列将适体序列连接于磁性微球，加入OTA和生物素修饰的报告序列竞争结合适体，然后加入与生物素特异性结合的链霉亲和素金纳米粒子，OTA加入量越多，磁性微球上生物素修饰的报告序列随着适体离开而脱离的越多，导致留在磁性微球上的金纳米量越少，从而实现OTA的检测。另外，利用羟胺/Au3+在较小粒径的金粒子表面可聚集形成更大颗粒的金粒子的特点，可极大提高化学发光检测OTA的灵敏度。实验原理如图1所示。

图1 羟胺放大金纳米粒化学发光检测OTA的检测原理图Fig.1 Schematic representation of hydroxylamine amplified AuNPs assay for OTA by chemiluminescence

图2 金纳米的粒径分布图Fig.2 Size distribution of AuNPs

图3 纳米金溶胶的紫外-可见光吸收光谱图Fig.3 UV-Vis absorption spectrogram of AuNPs

2.2 纳米金的表征

采用马尔文粒度仪测定所制备的金纳米粒径，并用紫外可见分光光度计扫描其最大吸收峰。金纳米粒子的粒径分布如图2所示，结果得出粒径的平均值为21.04 nm。紫外-可见光吸收光谱图如图3所示，由图可知，紫外光谱的最大吸收峰为520 nm，无其他杂峰，且其吸收峰的宽度较小，说明此纳米金溶胶纯净且粒径分布均匀。

2.3 检测条件的优化

2.3.1羧基磁性微球用量的优化羧基磁性微球载体是实现传感器纯化分离的重要保障。在其他反应条件相同的情况下，考察了不同磁性微球用量(20、40、60、80、100 μg)对CL信号的影响。结果显示，当羧基磁性微球用量为40 μg时，ΔCL信号值(化学发光空白值与实验值的差值)达到峰值，此后随着磁性微球用量的增加ΔCL信号值反而下降。这可能是由于磁性微球表面结合的捕获探针用量增加，使得与捕获探针杂交的OTA适体量也增大，从而导致ΔCL信号值下降。因此，羧基磁性微球的最佳用量为40 μg。

2.3.2氨基捕获探针用量的优化实验对氨基捕获探针用量(10、15、20、25、30 pmol)进行了优化，结果表明当氨基捕获探针用量为20 pmol时，ΔCL信号值达最大，此后随着捕获探针用量的增加，ΔCL信号值急剧下降。这可能是由于磁性微球表面单位面积结合了过多的捕获探针，增加了空间位阻，从而降低了捕获探针与OTA适体的杂交效率，导致ΔCL信号值下降。因此，捕获探针的最佳用量为20 pmol。

2.3.3OTA适配体用量的优化实验对OTA适配体用量(2、5、10、15、20 pmol)进行了考察，结果显示，当OTA适配体用量为10 pmol时，ΔCL信号值达最大值，此后随着OTA适配体的用量增加，ΔCL信号值下降。可能是由于过量的OTA适配体使得磁性微球上连接的OTA适配体用量增加，CL信号值增大，从而使ΔCL信号值降低。因此，OTA适配体的最佳用量为10 pmol。

2.3.4生物素化报告序列用量的优化实验对生物素化报告序列用量(5、10、20、30、40 pmol)进行了考察，结果显示当生物素化报告序列用量为20 pmol时，ΔCL信号值达最大值，之后随着生物素化报告序列用量的增加ΔCL信号值下降。这可能是由于磁性微球表面的报告序列过于密集，影响了生物素与链霉亲和素纳米金的结合，从而导致ΔCL信号值下降。因此，生物素化报告序列的最佳用量为20 pmol。

2.3.5金纳米粒子颗粒直径的优化不同用量的柠檬酸三钠会得到不同直径的金纳米粒子[18-21]，实验对柠檬酸三钠的用量(1.4、2.6、4、6、8 mL)进行了考察，结果表明当柠檬酸三钠的用量为4 mL时(金纳米粒子的直径约为20 nm)，ΔCL信号值达到最大，此后随着柠檬酸三钠用量的增加ΔCL信号值下降。因此，金纳米粒子颗粒的最佳直径约为20 nm。

2.3.6SA-AuNPs用量的优化实验用1% PVP对不同SA-AuNPs稀释倍数(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)进行了考察，结果显示，随着稀释倍数的增加，ΔCL信号值也增加，当稀释倍数为1∶3时，ΔCL信号值达到最大，此后随着稀释倍数的增加ΔCL信号值下降。因此，SA-AuNPs最佳的稀释倍数为1∶3。

2.4 标准曲线的建立

在优化的实验条件下(40 μg羧基磁性微球，20 pmol氨基捕获探针，10 pmol适配体，20 pmol生物素化报告序列，20 nm金纳米粒子，1∶3的SA-AuNPs)，对一系列不用浓度的OTA进行化学发光检测，建立标准曲线。结果显示，在OTA质量浓度为0.01～50 ng/mL范围内，ΔCL信号值(Y)与OTA质量浓度的对数(X)呈良好线性关系，线性方程为Y=1.80×105X-1.81×105，r2=0.992 5，检出限(L=KSb/S,K=3)为1.58×10-3ng/mL。

2.5 检测性能评价

实验对啤酒样品进行前处理[22]，将啤酒在声波浴中加热脱气30～60 min，取10 mL啤酒加入0.1 g PVP，将混合物在室温下摇动2 min。过滤后，将溶液调至pH 7.2，稀释100倍后于4 ℃保存备用。选取3个不同浓度水平的OTA(1、5、10 ng/mL)对啤酒进行加标回收试验，平行测定3次。结果显示，平均回收率为97.4%～105.4%，相对标准偏差(RSD)为4.0%～5.5%。本方法准确性较高，精密度良好，可用于实际样品中OTA的检测。

表1比较了近年来不同方法对OTA的检测结果，发现本方法具有较高的灵敏度，线性范围更宽，且操作简单更有利于实际操作。

表1 不同分析方法检测OTA的比较Table 1 Comparison of methods for OTA detection

3 结 论

本实验以磁性微球作为固定载体，通过适体技术将AuNPs应用于化学发光检测技术，并利用羟胺/Au3+在小粒径的AuNPs表面具有沉积效应的特性来显著提高检测灵敏度，从而构建了一种高灵敏度检测OTA的化学发光方法。加标回收结果表明本方法可用于实际样品中OTA的检测。此外，本方法兼具适配体和AuNPs的优势，灵敏度高、成本低且能快速筛查，为食品药品安全检测及分析提供了一种快速、简便、灵敏的分析手段。

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