原子转移自由基聚合法合成磺胺类片段印迹聚合物及其表征

梁雨涛,宋立新,卜忐忐，李媛媛，巴 鑫，何 娟*,游利琴,谷克仁

(1.河南工业大学 化学化工与环境学院，河南 郑州 450001；2.河南水利与环境职业学院 环境工程系，河南 郑州 450001 )

磺胺类药物是一种人工合成的抗菌药，其价格低廉，在兽医临床上疗效较为显著，因此应用越来越广泛[1]。然而，滥用兽药极易造成动物源食品中有害物质残留，不仅对人体健康造成危害，而且对畜牧业的发展和生态环境也造成极大危害[2-3]。因此兽药残留的有效检测对人类的饮食安全极为重要。

目前应用较为广泛的兽药残留检测方法均以高效液相色谱、液相色谱和质谱联用等精密仪器进行检测[4-6]，因此对实际样品进行更为有效的前处理变得更为关键。分子印迹固相萃取是一种重要的样品预处理技术，具有选择性高、稳定性好和适用性广等特点；同时利用该技术可合成对模板分子具有专一性识别作用的聚合物，能有效在复杂基质中吸附目标分子[7-9]。

原子转移自由基聚合法(Atom transfer radical polymerization，ATRP)是一种新型高效合成聚合物的方法，可将活性差别较大的单体相结合，聚合反应后可以形成共聚单体随时间的延长呈梯度变化的梯度共聚物，并且此方法适用的单体种类较多，大多数单体如苯乙烯、甲基丙烯酸酯等均可顺利反应，且反应过程可控，有利于获得符合分子量要求的聚合物。片段印迹技术是在聚合反应的过程中，加入目标分析物的一个片段或其结构类似物作为替代模板合成一种新型的印迹聚合物。因大部分目标分析物为有毒有害物质，此方法可有效避免目标分析物的泄露，减少对有害物质的使用，同时若洗脱过程中模板分子未洗脱完全，液相色谱分析时亦不会对目标分析物产生影响[10-12]。因此在本实验中尝试使用原子转移自由基聚合与片段印迹技术相结合的新方法。

本文以食品中残留的磺胺类物质作为研究对象，以磺胺类物质的结构类似物4,6-二氯嘧啶作为替代模板，利用原子转移自由基聚合法制备片段印迹聚合物，考察反应条件对其外观特性、吸附、选择和排阻性能等的影响规律。以合成的聚合物为新型材料，对样品中的兽药残留进行分析测定。通过电镜扫描对所合成聚合物的表面形态进行表征。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

LC-10AT高效液相色谱、UV2550紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)。

1.2 印迹聚合物的制备

取2，2′-联吡啶 40.95 mg(0.25 mmol)、环己酮13.9 mL、 GMA 5.75 mL(45 mmol)和氯化苄23 μL，置于三口烧瓶内，通氮气除氧。加入CuCl 17.3 mg和 4，6-二氯嘧啶0.4 g(2.5 mmol)，超声使其溶解，抽真空，再通入氮气3 min，反复3次。在60 ℃下机械搅拌5 h。反应结束后，取200 mL甲醇于烧杯中，磁力搅拌，将反应溶液匀速滴加到烧杯中得白色固体，抽滤，烘干备用。

将制得的印迹聚合物(MIPs)用甲醇-乙酸(9︰1，体积比)混合液进行洗脱，至检测不出模板分子，换用纯甲醇洗至溶液呈中性。烘干备用。

采用相同比例和方法制备非印迹聚合物(NIPs，未加模板分子)。

1.3 聚合物的吸附性能

分别称取MIPs和NIPs 30 mg，量取4 mL质量浓度为100 mg/L的 SMZ标准溶液，手动振荡，放置24 h。以甲醇-水(9︰1，体积比)作为高效液相色谱法(HPLC)测定的流动相，测定波长为220 nm，流速为1 mL/min。根据高效液相色谱可以测得一定浓度标准溶液的峰面积，然后依据峰面积与溶液浓度的线性关系绘制标准曲线，根据公式Q=(C1-C2)×V/m计算MIPs和NIPs的相对吸附量Q(mg/g)。式中，C1为 SMZ标准溶液的原始质量浓度(mg/L)；C2为吸附后SMZ标准溶液底物的质量浓度(mg/L)；V为 SMZ标准溶液的体积(L)；m为印迹聚合物的质量(g)。

1.4 吸附等温线测试

称取12份质量为30 mg的MIPs，编号为1～12,分别加入质量浓度为40～140 mg/L的SMZ标准溶液4 mL，静置24 h后测定。计算MIPs的相对吸附量Q(mg/g)，平行测定3次取平均值。

NIPs测定方法同上。

1.5 吸附速率测试

准确称取11份质量为30 mg的MIPs，编号1～11,分别加入100 mg/L的SMZ标准溶液4 mL。1～4号每隔1 h测1次，5～8号每隔2 h测1次，9～11号每隔5 h测1次。计算MIPs的相对吸附量Q(mg/g)，平行测定3次取平均值。

1.6 选择性吸附测定

称取MIPs 30 mg，分别加入50 mg/L的SMZ、SMM、SD、SM2的混合标准溶液4 mL，振荡，吸附14 h。高效液相色谱法测定条件：流动相为乙腈-水(2︰8，体积比)，测定波长为254 nm，流速为1.0 mL/min。计算MIPs的相对吸附量Q(mg/g)。

NIPs测定方法同上。

1.7 实际样品的分析

称取MIPs 200 mg，用甲醇和水活化后湿法装柱。选择某品牌牛奶作为实验样品，称取适量，加热煮沸除去上层脂肪，冷却后准确称取10.0 g，以1.0 mL/min的流速通过固相萃取柱，待全部流出后，用5 mL蒸馏水淋洗，3 mL甲醇洗脱，测定牛奶中的兽药残留。高效液相色谱法测定条件：流动相为乙腈-水(2︰8)，测定波长为254 nm，流速为1.0 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1反应温度对聚合物吸附量的影响在ATRP反应中，若温度过高，溶液中分子碰撞的几率大大增加，形成的颗粒大小不均，进而影响吸附性能，并且高温(高于80 ℃)会引发GMA自身环氧键的断裂，引入副反应，影响实验结果；而温度太低(低于50 ℃)，无法使引发剂发挥作用，反应不充分。因此实验考察了反应温度(50、55、60、65、70、75 ℃)对聚合物吸附量的影响。结果显示，在60 ℃时合成的印迹聚合物的吸附性能最好，吸附量最大(1.05 mg/g)，故选择最佳反应温度为60 ℃。

2.1.2模板用量对聚合物吸附量的影响分子印迹技术利用洗脱模板后的三维空穴来达到选择性识别的效果。在原子转移自由基聚合方法中，模板用量过多，会使反应溶液浓度过大，聚合反应过慢，同时也会影响产率；模板用量少，会使聚合物孔穴利用率降低，影响聚合物的吸附能力。故设计用量比例如表1所示。吸附量测试和聚合物的外观显示，模板用量为0.3 g时，MIP的性状较为疏松，呈白色均匀粉末状，吸附量最大。

表1 模板用量对聚合物性状和吸附量的影响Table 1 Effect of template amount on polymer properties and adsorption capacity

2.2 正交试验

在上述单因素实验的基础上，采用四因素(A为模板用量，B为单体GMA用量，C为配体BPY用量，D为温度)三水平的正交试验，对合成条件进一步优化(表2)。

表2 MIPs合成的正交实验Table 2 Orthogonal experiments on MIPs synthesis

由表2选出最优合成条件：温度为60 ℃，模板用量为0.3 g，GMA 用量为5.75 mL，BPY用量为40.95 mg，在此条件下合成聚合物，并测得其对SMZ溶液的吸附量为1.48 mg/g。与正交表的直观分析结果相符。对比各因素的极差大小可知，四因素中模板用量是影响聚合物性能的显著性因素。

2.3 片段印迹聚合物的电镜扫描图谱

如图1所示，通过对合成的聚合物进行电镜扫描，发现聚合物为表面疏松多孔的颗粒，保证了合成的分子印迹聚合物具有较好的吸附性能和重现性。

图1 片段印迹聚合物的扫描电镜图Fig.1 Scanning electron microscopy of fragment imprinted polymersA：1 000×；B：16 000×

图2 吸附等温线Fig.2 Adsorption isotherms

图3 MIPs和NIPs对4种磺胺类物质标准溶液的吸附量Fig.3 Adsorption of standard solutions of four sulfa drugs by MIPs and NIPs

2.4 吸附等温线测定

按照“1.4”方法进行吸附等温线测试，结果见图2。由图2可知，MIPs和NIPs的吸附量均随标准液浓度的增加而增大，且两者吸附量的差值随浓度的增大而逐渐增加。这说明原子转移自由基聚合法合成的片段印迹聚合物具有更多的吸附孔穴以及更好的吸附性能。

2.5 吸附速率测定

按照“1.5”方法进行吸附速率测定，实验结果表明，印迹聚合物的吸附量随吸附时间的延长不断增加，但吸附时间大于11 h后，聚合物的吸附量基本不再变化，说明聚合物的有效吸附主要集中在前11 h。

2.6 选择性吸附测定

按照“1.6”方法进行吸附选择性测定，结果见图3。由图3可知，合成的印迹聚合物对SMZ有更好的选择性，对SMZ的结构类似物SMM、SD、SM2均有吸附且吸附量大于NIPs，说明合成的印迹聚合物能够有效吸附磺胺类物质。对比MIP对4种磺胺类物质的吸附结果，发现聚合物对SMZ的吸附量最大，这是由于选择的模板4,6-二氯嘧啶与SMZ的结构更相似。

2.7 牛奶样品的测定

对牛奶样品进行测定，发现合成的MIPs对磺胺类似物显示出较高的选择性能和吸附性能，经过SPE柱后分析目标物被保留而杂质不被保留，分析样品得到了浓缩和净化。分析结果显示，本地牛奶中SMM、SD、SM2的含量分别为0.19、0.27、0.07 μg/kg，均小于国标中规定的磺胺类兽药残留限量1.0 μg/kg，且未检出其他磺胺类物质。

3 结 论

以4，6-二氯嘧啶为替代模板合成片段印迹聚合物，通过正交试验得出最优反应条件为模板用量0.3 g，GMA 用量5.75 mL，BPY用量40.95 mg，即模板、功能单体、配体的摩尔比为10︰180︰1，反应温度为60 ℃，反应时间为5 h。选择性吸附试验及对牛奶样品的检测结果表明，利用原子转移自由基聚合法和片段印迹技术相结合的新方法合成的新型片段印迹聚合物，对复杂的混合样品及实际样品均有较好的选择性能和吸附性能，可用以制备固相萃取的吸附填料，在针对兽药残留分析的前处理过程中具有广阔的应用前景。

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