免疫球蛋白G 提纯方法的研究进展

李登亮， 伊淑帅， 郭衍冰，2， 刘宏凯， 牛江婷， 董国英， 胡桂学

(1. 吉林农业大学动物科学技术学院， 吉林 长春 130118 ；2. 吉林省畜牧兽医科学研究院， 吉林 长春 130022；3. 北京师范大学全球变化与地球系统科学研究院， 北京 海淀 100875)

免疫球蛋白(IgG)是血液中除白蛋白外最丰富的蛋白，由通过二硫键连接的两条轻链和两条重链组成，呈“Y”型。 免疫球蛋白(IgG)约占血液总免疫球蛋白的75%，并且是与体液免疫应答相关的主要免疫球蛋白[1]，作为参与机体对抗感染的主要分子，具有与病原体或毒素结合，激活补体，加强吞噬作用的杀伤作用，启动过敏反应和减轻移植器官排斥的能力，是临床应用中使用最广泛的免疫球蛋白[2-3]。 IgG 与其他免疫球蛋白相比，具有持续时间长、含量高、稳定性强等优点，一般情况下，通过对动物机体或动物性产品内特异性IgG 含量的测定，可判断该动物是否曾患有相关疾病或其产品是否合格，这在动物的出入境检验检疫及其产品的质量评价中应用十分广泛，因此IgG 的分离纯化倍受关注。本文对不同的血清IgG 提纯工艺进行了详细的阐述与比较，以期为IgG 生产工艺的改良提供理论参考。

1 免疫球蛋白的粗提

1.1 有机溶剂沉淀法 目前，有机溶剂沉淀法是一种被广泛应用于蛋白质制剂生产的提纯方法，其中，低温乙醇沉淀法是生产中应用最为广泛的一种方法，也是WHO 规程和中国生物制品规程推荐用的方法。该方法是1949 年由美国科学家Cohn 等首次提出，用于制备血清IgG，其作用原理是利用有机溶剂改变溶液的介电常数，从而通过控制蛋白质之间静电相互作用的办法选择性地沉淀蛋白。 低温乙醇沉淀法可同时分离多种血浆成分，具有良好的分辨率和纯化效果，而且对细菌和病毒有消除灭活的作用。 但该方法存在的不足也不容忽视，如40% ～50%的IgG 可能在非IgG 上清液中丢失或与杂质共沉淀。 此外，沉淀阶段需要在低于0 ℃的温度下进行，以避免蛋白质的变性[4]。 高浓度的乙醇也会影响IgG 的稳定[5]。

1.2 盐析法 盐析法的原理是根据不同蛋白质在同一浓度的盐溶液中溶解度不同及同一蛋白质在不同浓度的盐溶液中溶解度也不同，从而通过改变盐溶液浓度达到目的蛋白(如IgG)与其他杂质蛋白分离纯化的目的。 常用的盐析法有饱和硫酸铵分步沉淀法、多聚磷酸钠絮凝法、FeCl3沉淀法等。

1.2.1 饱和硫酸铵分步沉淀法 饱和硫酸铵分步沉淀法在人以及哺乳动物血清蛋白的分离纯化中得到了广泛的应用。 由于水中的硫酸铵溶解度大且受温度影响小，一般不会引起蛋白质的变性；此外，高浓度硫酸铵对微生物和蛋白酶具有抑制作用，从而保护蛋白质生物活性。 Mariam S H S 等通过饱和硫酸铵沉淀法成功地纯化针对乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的IgG，回收率和纯度分别为99%和94%[8]。 IgG 的提取过程中，如果结合蛋白质的等电点(pI)沉淀就更有利于除去杂蛋白。 如在提纯猪血清IgG 时，37%硫酸铵饱和度下，pH 值4.5时IgG 回收率为70%，而pH 值7.4 时IgG 回收率达到80.5%[6]。 该方法操作简单，产品含量和得率都较高，利于工业化大量生产。 缺点是沉淀的抗体必须再溶解并存在蛋白质聚集体，且盐析过程所花费的时间较长[9]。

1.2.2 多聚磷酸盐或FeCl3沉淀法 相对于硫酸铵沉淀法，多聚磷酸盐沉淀法或FeCl3沉淀法提纯IgG 更安全可靠，尤其是当IgG 作为医药行业和保健食品行业的重要添加剂。 多聚磷酸盐作为食品添加剂可以在肉制品中使用以提高产品的保水性，或者作为絮凝剂用于食品加工。 而FeCl3沉淀法从原料中提取的IgG 溶液中只含有Fe3+离子，只调节pH 值至弱碱性，Fe3+离子就会和水中的OH-离子结合成Fe(OH)3沉淀，方便快捷的达到了除盐的效果，即使残存少量的Fe3+离子也对人体有益处。 罗磊采用多聚磷酸盐沉淀法及FeCl3沉淀法成功从猪血清中提纯IgG，并表明FeCl3分离猪血清IgG 操作简便，分离效果好，安全可靠，实用性高，可以用于食品用IgG 的工业化生产[6]。 庞晨通过这两种方法成功从牦牛血清中分离纯化IgG，得率分别为6.48 mg/mL 和8.28 mg/mL[7]。

1.3 正辛酸-硫酸铵法 正辛酸-硫酸铵法是将有机溶剂辛酸与无机盐硫酸铵相结合的一种提纯免疫球蛋白的方法。 其提纯IgG 的原理是pH 值为4.2 ～4.8 条件下辛酸可沉淀血清中的非免疫球蛋白类蛋白，含免疫球蛋白的上清液再用饱和硫酸铵沉淀法，从而对血清中的IgG 进行分离纯化。 有试验表明，一定浓度的辛酸主要使血清中的白蛋白沉淀，而不会影响免疫球蛋白的分级纯化[10，11]，并且在免疫球蛋白沉淀过程中，辛酸还可避免免疫球蛋白的降解或聚集[12，13]。 该方法允许球蛋白浓度≥15 ng/mL，比较适合于大量、高效价血清IgG 提纯，且简单易行，无需复杂的设备仪器。 缺点是IgG 需要溶解，在商业规模生产中，操作步骤增加会使分馏过程易受微生物污染。

2 免疫球蛋白的进一步纯化

免疫球蛋白经粗分级后，为了得到更高纯度的IgG，通常要进行细分级，这一过程常采用柱层析的方法。 常见的有凝胶过滤层析法、离子交换层析法、亲和层析法等，细分级后IgG 的纯度一般可达到90%以上。

2.1 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析法是一种呈温和的物理性纯化方法，一般不影响蛋白质分子的生物活性，该法是基于样品中蛋白质分子的相对大小和立体结构差异，在通过多孔凝胶介质时达到分离纯化目的[15]。 对于Ig 类抗体，凝胶过滤层析可去除与目的抗体具有相同电荷性的杂质[14]。 当然，相对于亲和层析法分离纯化目的蛋白，凝胶过滤层析的特异性相对较差，且因靶蛋白在柱中不能被保留而呈现相对较低的分辨率，但该方法仍是与其他类型纯化组合使用的有价值的方法。

2.2 离子交换层析 离子交换层析是根据蛋白质分子所带电荷及电荷密度不同，通过不同蛋白质吸附到吸附剂上的能力差异来实现分离纯化免疫球蛋白。 蛋白质是由氨基酸构成的两性电解质，其所带电荷由溶液pH 值所决定，且在低离子强度时可被同性的离子竞争置换而解脱，通过增强洗脱液的离子强度或改变pH 值来改变蛋白质的结合能力，使不同电荷的蛋白质得以分离。 Wongchuphan 等成功从兔血清中提纯IgG，产率为80%，纯度达到83%[16]。 该法提纯IgG 也存在一些不足，如用时长，装柱要求高，期间也会由于各种因素影响而使蛋白质变性，易变性失活的抗体不宜采用此方法。

2.3 亲和层析 亲和层析是一种特异性吸附层析技术，其原理是以目标分子与亲和配体特异性、可逆性结合为基础，通过生物高分子所特有的生物活性而进行的蛋白质分离、提纯和浓缩。 亲和层析具有高效、快速、纯化结果好等优点，并逐渐成为大分子生物提纯技术之一。 但存在偶联配体纯度要求高；目的蛋白活性可能被洗脱液损害，成本高，费用大等弊端。 因此，许多研究者试图构建纯化配体作为蛋白A 的替代[17-18]。 Tomoya Sugita 等[19]使用肽阵列筛选结合IgG 的Fc 区的肽配体，获得可识别结合人和小鼠IgG 的高亲和力八聚体肽NKFRGKYK和NARKFYKG，抗体获得的产量分别为69% 和80%，从而表明筛选的肽可用作IgG 的亲和纯化配体。 可见，亲和层析过程亲和配体的选择逐渐成为IgG 纯化的热点问题。

3 展望

免疫球蛋白具有很多重要的生理功能，尤其是IgG，其不仅在血液免疫球蛋白中含量丰富，而且在临床诊疗、生物制药、疫苗生产、疾病预防及食品添加等领域已经广泛被应用。 随着近年来免疫学和遗传工程的发展，对具有高纯度，强生物活性和低成本的抗体的需求变得越来越迫切。 因此，IgG 的制备已经成为当前研究热点之一，许多新型方法应运而生。 双水相系统就是利用蛋白质分子可以被特定相稳定萃取，从而增加目标蛋白质(IgG)浓度，达到更有效地萃取效果[20]。 天然IgG 结合蛋白如蛋白A 和来自细菌来源的蛋白G 已被普遍用作配体。 然而由于该配体的生产成本高，稳定性差，存在宿主细胞成分的污染，以及需要开发柱结合抗体的温和洗脱条件等，所以为了补充天然蛋白质配体，一些由天然或非天然氨基酸组成的肽合成配体得到了广泛的探索并已经被成功开发[21-22]。 然而当前应用于工业生产的抗体分离纯化工艺比较传统，这就需要寻求一种将传统生产与新型工艺相结合的得率高、对抗体活性无影响、节约成本、可加工集成的方法来代替传统工艺。 随着IgG 提取纯化技术的更新发展，免疫球蛋白提纯必将实现工业化量产，其应用范围也会进一步扩大，因此对IgG 的开发应用前景相当乐观。