细小病毒宿主进化的研究进展

孙明洁， 董国英， 董 洁， 张雪竹， 曾 倩， 王 开， 胡桂学

(1.吉林农业大学动物科学技术学院， 吉林 长春 130118 ；2.北京师范大学全球变化与地球系统科学研究院，北京 海淀 100875 ；3.吉林农业大学生命科学学院， 吉林 长春 130118)

细小病毒作为一种宿主广泛的病毒，流行已将近一个世纪。 而今，已成为侵染动物最频繁的病毒之一。 第一例猫细小病毒(Feline parvovirus virus，FPV)是在20 世纪初期由法国学者Verge 发现，随后由Bilin 和Johnson 于1957 年成功分离培养出该病毒[1]。 . FPV 属于细小病毒科、细小病毒属成员，该属病毒是自然分布极广的一种微小的单股负链DNA 病毒粒子。 自FPV 被发现以来，相继衍生出犬细小病毒(Canine parvovirus， CPV)、水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus， MEV)和浣熊细小病毒(Raccon parvovirus， RaPV)等[2]。 近几年研究发现该属病毒成员不断增多，如博卡病毒(Bocavirus)等，严重危害了人兽健康。 由于细小病毒的迅速传播和基因突变等变化，导致病毒产生较强的致病力和抗原漂移现象[3]。 同时细小病毒宿主范围仍在不断地扩大更新，现在已成为猫科、犬科、经济动物和珍稀野生动物的主要疫病之一。

犬细小病毒基因组长约5 000 nt，无囊膜，直径约为26 nm，有两种mRNA 启动子和单一的多聚位点A，由结构蛋白(VP1、VP2 和VP3)和非结构蛋白(NS1 和NS2)组成病毒粒子。 从犬细小病毒变异过程发现，CPV 从CPV-2a、CPV-2b 到CPV-2c 都是在VP2 蛋白上发生重要氨基酸位点变异，导致病毒受体改变造成其感染多种宿主[4，5]。 近些年有学者陆续报道虎源、豹源、熊猫源及灵长类猴源FPV 和CPV 的感染，为我国的珍稀野生动物保护带来巨大的威胁[3，6]。 因此本文对当前细小病毒感染多种动物的现状进行综述分析，以便为珍稀野生动物的保护提供基础资料。

1 细小病毒的变异

犬细小病毒作为一种FPV 样病毒，目前已出现CPV-2、CPV-2a、CPV-2b 和CPV-2c 等变异毒株，其基因变异率与某些RNA 病毒突变率相当[7]。 研究发现CPV-2 变异毒株不仅致病性增强，而且其可感染猫源细胞系CRFK 细胞，甚至可以在猫的多种器官复制增殖[8，9]。 CPV-2 多种亚型毒株VP2 基因发生多处变异，其中300 处氨基酸残基的突变被认为是可以感染猫的主要原因，且经过连续传代也同样适应猫细胞系的培养。 因此，随着CPV 的持续变异，宿主范围也将不断扩大，对犬、猫科等多种珍稀野生动物的威胁也在不断提高。

2细小病毒宿主扩展机制

2.1 自然特异性适应 细小病毒几种亚型毒株的出现，导致其自然特异性宿主发生改变。 然而，病毒的宿主改变机制仍然值得探索分析。 病毒变异的主要原因多为长时间的疫苗免疫压力、因环境变化产生的自然选择，病毒感染动物后发生基因重组等。 其中被广泛认可的假说是通过感染中间宿主(猫科和犬科等肉食兽)致使基因发生变异而导致宿主扩展[10]。 有研究表明，在哺乳动物中有超过280 种食肉动物，其中可作为CPV 与FPV 的天然储存宿主的动物仍然还很模糊，但众所周知的是，野生食肉动物均可感染这两种病毒。 通过进化分析可知，细小病毒在野生食肉动物和家养动物之间的传播很可能是普遍且双向传播的。 因此有研究发现，浣熊细小病毒作为变异的CPV 株在未鉴定的宿主范围内传播流行将近24 年，同时对VP2 基因分析显示，当前多数浣熊细小病毒作为CPV-2 和CPV-2a 的进化中间体[10-11]。 因此，细小病毒在传播变异过程中发生宿主多重适应性转变，而中间体很可能作为病毒多宿主转移和进化的桥梁。

2.2 VP2 变异诱导宿主扩展 VP2 蛋白不仅是构成核衣壳的主要成分，同时也是抗原决定簇所在区域，VP2 蛋白可决定宿主选择、受体结合等一系列感染过程。 近些年来细小病毒VP2 蛋白不断变异，产生了较多的变异毒株同时也扩大了其宿主范围。从FPV 到CPV-2c 期间VP2 蛋白共发生15 处氨基酸突变，VP2 蛋白300aa 位置的突变一直贯穿整个变异过程，VP2 蛋白最显著的突变是300aa 处Gla突变为Asp 已经出现五次。 为了证明，VP2 300 突变对受体结合的影响，有研究通过生物层干涉测量法分析了FPV VP2 300-Asp 和300-His 突变体与重组猫TfR 的结合动力学，结果显示，在VP2 300 处从Asp 突变为His 后FPV 与受体结合显著增加，亲和常数KD值300-Asp 为1.2 ×10-8M 和300-His 为4.06 ×10-9M 与绘制增长曲线数据一致，证明了VP2 300-His 突变体比300-Asp 突变体与猫TfR 结合的更紧密[12]。 有研究发现，从浣熊分离的CPVlike 病毒不能与犬的TfR 结合而不感染犬细胞，但是通过对浣熊CPV 毒株(Rac 118)在A72 细胞传代培养，VP2 300 处由Asp(GAT)转变为Gly(GGT)后，浣熊CPV 重新获得了感染犬的能力。 该研究又对Rac 334 毒株培养发现VP2 300 Asp(GAT)转换为Val(GTT)，同样获得了感染犬细胞的能力，针对浣熊细小病毒的研究发现，VP2 300 位氨基酸残基处不同的突变，均能改变其宿主范围，最终鉴定证实浣熊CPV VP2 300 位氨基酸的变化可使其感染犬、猫、雪貂和貂的细胞，从而扩大宿主范围[13-14]。为了进一步揭示VP2 300 位如何影响病毒的感染，通过对Rac118(0 代300-Asp，20 代300-Gly)接种多种宿主动物包括家猫、犬和雪貂等细胞系，结果表明，0 代和20 代的Rac118 感染NLFk 细胞数量相当，与自然中猫科动物易感染浣熊和犬源CPV 的结果一致，并不因基因变异而影响。 但是将Rac118(20 代300-Gly)在犬细胞上传代培养可导致雪貂细胞感染性显著的增长，而与非传代的Rac118 在A72和Mpf 细胞高度耐受相违背。 正常在犬细胞培养下，感染Rac118 与300-His 密切相关而不是300-Gly，预示浣熊源CPV 适应一个宿主后在传代的不经意间使病毒更适应于另一种新宿主[13]。 VP2 300是CPV 中有最多的可变氨基酸的区域，该位点的不断变异也使其可感染多种食肉动物，表明该位点是细小病毒在不同食肉动物间跨物种进化的重要决定因素[15]。 然而，调控VP2 300 位氨基酸的突变具体因素和不同的氨基酸变异是如何诱导其感染新宿主的机制仍不清晰，希望在未来研究中得以揭示。

2.3 转铁蛋白影响机制 转铁蛋白受体(TfR)是通过结合和内化转运铁载体的一种Ⅱ型跨膜糖蛋白[16]。 TfR 可通过pH 值介导铁与转铁蛋白相互作用促进铁的吸收与释放，TfR 还有一个重要的功能是作为犬或猫细小病毒感染细胞的重要功能性受体，犬和猫体内转铁蛋白受体的结构差异决定了两种病毒的宿主特异性。 有研究表明，细小病毒衣壳蛋白与TfR 的特异性相互作用的结合调控着细小病毒感染的宿主范围，因此无论衣壳蛋白的变异还是TfR 的改变都会影响病毒宿主范围的变化。 TfR 顶端结构域残基的变化可影响着病毒的感染结合，而TfR 与衣壳蛋白的特异性结合很可能取决于特异性宿主和病毒结构的变化[17]。 当CPV 感染细胞时TfR 与衣壳蛋白的结合是通过网格蛋白介导胞吞实现的，并在低pH 值条件下在细胞系统内进行复杂的转运。 因此，有研究为了确定TfR 结构与细小病毒衣壳蛋白结合的相互作用，改变了猫或犬TfR 的顶端结构域或者制备了这些受体的嵌合体，并检测改变的受体与FPV 或CPV 衣壳蛋白的结合效果，结果显示，猫TfR 的顶端结构域中的大部分变化不影响结合，但是用Ser 或Asp 取代Leu221 可阻止TfR与FPV 或CPV 衣壳蛋白结合，而用Lys 取代Leu221产生，仅结合CPV 但不结合FPV 的受体。 对猫和犬TfR 的重组体的分析显示，控制CPV 特异性结合的序列在顶端结构域内，并且这些受体基因序列之间不止一个氨基酸的差异决定了犬TfR 与CPV 特异性结合[19]。 Palermo 等将昆虫细胞表达的犬和猫TfR 纯化后与CPV-2、CPV-2b 和FPV 衣壳蛋白进行互作，显示猫的TfR 可与FPV 和CPV-2 衣壳蛋白紧密结合而与CPV-2b 结合的却很弱，犬的TfR 与CPV-2、CPV-2b 的衣壳蛋白结合水平较低，与FPV衣壳蛋白几乎不能结合，但是顶端结构域变异的犬TfR 却可与CPV-2、CPV-2b 和FPV 衣壳蛋白结合，并可获得与猫TfR 相似的结合水平，这暗示TfR 的变异也是改变细小病毒宿主的重要因素[20]。 实际上犬和猫TfR 氨基酸相似性可达89%，但犬TfR 与CPV-2 和CPV-2b 衣壳蛋白结合较弱及不能与FPV结合，主要取决于TfR 顶端结构域几个氨基酸序列的差异，其中383 位和385 位犬TfR 氨基酸残基变化可使其获得与FPV 和CPV-2b 衣壳蛋白结合的能力。 而这几个氨基酸残基位点似乎在犬的TfR 上形成潜在的糖基化位点阻碍病毒感染，但是通过PNGase-F 去糖基化并不会使CPV-2 和CPV-2b 的衣壳蛋白与TfR 结合增强[12]。 因此TfR 顶端结构域的变化才是使细小病毒衣壳蛋白结合的主要决定因素，TfR 不仅管控着病毒的感染结合，同时也与病毒的致病机制等密切相关。

虽然细小病毒的衣壳蛋白与宿主TfR 结合对病毒的感染和转运有着复杂的影响，但是几乎没有仅通过某种病毒新型变异株导致的自然宿主发生改变的案例，然而犬细小病毒却成功突破自然宿主障碍获得了利于病毒流行的新宿主。 猫和犬TfR 与CPV 和FPV 衣壳蛋白的结合为细胞感染提供了所需的特定结构作用，使FPV 成功通过自然选择和基因突变实现了与犬TfR 结合的能力，并逐渐被CPV-2 的衍生毒株所取代[21]。

3 细小病毒跨宿主感染现状

细小病毒在变异过程中不断扩展其宿主范围，改变其组织嗜性使其成为多种野生动物主要的致病源。 有报道表明，FPV 可感染多种自然野生的猫科动物如虎、狮和豹等珍稀动物[22]。 刘永相等从我国东北虎粪便中成功分离一株虎源细小病毒HRBT2014，并对其VP2 基因序列比对和进化分析表明，相比CPV 该毒株与猫源细小病毒相似性较高[23]。近些年有研究陆续发现，大熊猫也可感染细小病毒，在福州大熊猫研究中心分离出一株细小病毒，通过VP2 基因分析发现其为CPV[24]。 2008 年，我国学者从实验动物养殖基地因腹泻致死猴身上分离出一株病毒，经系统分离鉴定为细小病毒，经测序分析表明其与FPV 和CPV 核酸同源性分别为98.75%和98.15%，并发现10 个重要氨基酸位点中有8 个与FPV 相同，2 个与CPV 相同，最终认定为其FPV 变异毒株[25]。 FPV 与CPV 不断变异引起宿主进化，严重影响着珍稀野生动物的安全，因此对细小病毒宿主进化机制的研究刻不容缓。

4 小结

FPV 和CPV 作为猫科和犬科的主要病毒，他们因其基因不断的变异出现跨宿主感染，严重威胁着野生虎、豹和熊猫等珍稀动物的安全。 然而，细小病毒的宿主进化机制的研究主要以VP2 蛋白300 位的变异和TfR 顶端结构域几个氨基酸的调控为主，但是其具体如何通过基因突变或TfR 调控导致抗原性、组织嗜性和宿主范围的改变仍然值得探索。 随着细小病毒研究的不断深入，希望在不久的将来能揭开其宿主进化机制，为病毒防控提供有效方案。