猪巴氏杆菌病诊断技术行业标准修订

李伟杰 ， 张 媛 ， 李 建 ， 魏财文 ， 蒋玉文

(中国兽医药品监察所 ， 北京 海淀 100081)

1 修订猪巴氏杆菌病诊断技术的必要性

猪巴氏杆菌病，又称猪肺疫，是危害我国养猪业的重要疫病之一，我国将之定为二类动物疫病。猪巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)引起的一种以败血症和炎性出血为特征的猪传染病。病原主要存在于病猪肺脏病灶及猪的上呼吸道与消化道中，随分泌物及排泄物排出体外，健康猪如接触病猪的排泄物被污染物时，经消化道和呼吸道传染，即可感染发病。当带菌猪由于受冷、感冒、饥饿、饲养管理不善、营养不良和寄生虫感染等，使抵抗力降低时，可促使猪发病。大小猪均有易染性，小猪和中猪发病率较高。一年四季都可发生，特别是春秋两季更易发生，此病多发生于其他传染病之后。也可呈地方流行性发生。每年我国生产约1.5亿头份各类猪巴氏杆菌病相关疫苗，尽管如此，各地仍有发病。

用特异性荚膜抗原吸附于红细胞上作被动血凝试验，可将多杀性巴氏杆菌分为A、B、D、E和F 5种血清群；利用菌体抗原作凝集试验，将本菌分为16个血清型。特异性荚膜抗原用大写英文字母表示，菌体抗原用阿拉伯数字表示，将菌体型和荚膜型两者结合起来表示，如5：A，6： B，2：D等。我国对本菌血清学鉴定表明，只有A、B和D 3个血清群，没有E和F血清群。猪以A型及B型为最常见。该病的病型、宿主特异性、致病性、免疫性等，都与血清型有关。

2001年Townsend通过消减杂交确定了多杀性巴氏杆菌种特异性基因kmtⅠ，针对该特异性DNA序列设计引物，所有的多杀性巴氏杆菌都可以扩增出一个460 bp的片段，由此建立了多杀性巴氏杆菌定种的PCR鉴定方法；另外，他对不同荚膜型的多杀性巴氏杆菌的荚膜合成相关基因进行了克隆和分析，多杀性巴氏杆菌荚膜型A、B、D、E、F菌株的生物合成位点的基因分别是hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecJ、fcbD等，针对这几种荚膜合成基因位点设计引物，扩增出的片段大小分别为1044、760、657、51l bp和851 bp，由此建立了荚膜分型PCR[1]。

行业标准《猪巴氏杆菌病诊断技术》(NY/T 564-2002)于2002年予以实施，其中病原鉴定、血清学试验等均通过菌株表型特征予以确定，广大兽医工作者参照此标准进行猪巴氏杆菌病的诊断[2-5]。近年来，分子生物学技术已经在巴氏杆菌病诊断中得以应用，这些新技术均相比传统诊断技术更加快速便捷。《猪巴氏杆菌病诊断技术》标准(NY/T564-2002)诊断周期较长，不适于该病的大规模快速诊断。因此，有必要对2002版标准进行修订，增加上述成熟的快速诊断技术，以便缩短疾病诊断周期，快速作出诊断，对防制起到积极作用。

2 修订猪巴氏杆菌病诊断技术的依据和基础

猪巴氏杆菌病诊断技术经过10余年的发展，许多新的技术，特别是分子生物学技术，已经在多杀性巴氏杆菌病诊断中得以应用。PCR方法采用的是设计一对针对基因组某保守基因的引物，进行体外核酸扩增，然后用琼脂糖凝胶电泳的方法来分离该扩增片段，并进行大小和序列分析。多杀性巴氏杆菌菌种特异性PCR对猪巴氏杆菌病的快速诊断意义重大。多杀性巴氏杆菌种特异性基因kmtⅠ是多杀性巴氏杆菌基因组上一个特有区域，针对本菌该特异性DNA序列设计引物，所有的多杀性巴氏杆菌都可以扩增出一个460 bp的片段。

传统的多杀性巴氏杆菌荚膜定型技术比较繁琐，个别菌株由于体外培养荚膜会消失，所以需要先回归动物，再重新分离细菌制备荚膜抗原进行间接血凝试验[6]。多杀性巴氏杆菌荚膜型A、B、D、E型菌株和F型菌株的生物合成位点的基因分别是hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD等，它们编码的荚膜多糖成分已经通过核磁共振检查研究证实。多杀性巴氏杆菌A型菌株的荚膜多糖成分是透明质酸；B型菌株的荚膜多糖是由阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖组成；D型菌株的荚膜物质是一种类似于肝素的多糖。针对这几种荚膜合成基因位点设计引物，扩增出的片段大小分别为1 044、760、657、51l bp和851 bp，由此建立了荚膜分型PCR。该方法也得到国内研究者的证实[7-9]。

Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2014已将kmtⅠ作为靶基因建立多杀性巴氏杆菌的PCR诊断技术，用于出血性败血症的病原鉴定，同时在牛出血性败血症和猪萎缩性鼻炎的病原多杀性巴氏杆菌的荚膜定型中应用了多重PCR。本课题组运用建立的多杀性巴氏杆菌定种PCR和荚膜定型多重PCR对60株多杀性巴氏杆菌进行了鉴定，结果与16S rDNA PCR和间接血凝试验结果的符合率均达100%[10]。以上研究为本标准的修订提供了理论和技术支持。

3 修订猪巴氏杆菌病诊断技术的主要工作过程

从中国兽医微生物菌种保藏管理中心领取63株不同型的致病性猪源多杀性巴氏杆菌，获得纯培养物。采用细菌16S rDNA通用引物对所领取的63株菌的16S rDNA进行扩增，经核酸序列比对确定该63株菌中有60株为多杀性巴氏杆菌。合成多杀性巴氏杆菌种特异性引物及对应于荚膜A、B、D血清型基因的特异性引物，用多杀性巴氏杆菌种特异性PCR方法对已确定为多杀性巴氏杆菌的60株菌进行种鉴定，结果均吻合。制备了多杀性巴氏杆菌荚膜定型血清，用传统的间接血凝试验及荚膜定型PCR方法对上述60株猪多杀性巴氏杆菌进行荚膜定型，结果也均一致。结合研究结果，将通过PCR确定多杀性巴氏杆菌种及荚膜血清型的方法优化，规范和制定所有的操作过程和细节，对《猪巴氏杆菌病诊断技术》(NY/T 564-2002)进行修订，起草修订草案。委托与本专业相关的11家技术单位对本标准修订草案进行技术复核并提出修改意见和建议。对征集到的意见及建议进行汇总，根据技术复核单位的复核结果及提出的修改意见对《标准》进行修改完善，形成送审稿。参加全国动物卫生标准化技术委员会组织专家召开的标准审定会，按照专家意见对《标准》再次进行修改完善，形成报批稿。2016年10月26日农业部发布为中华人民共和国农业行业标准(农业部公告第2461号)，自2017年4月1日起实施[11]。

4 修订猪巴氏杆菌病诊断技术的技术复核

将25株荚膜A型多杀性巴氏杆菌、18株B型多杀性巴氏杆菌、10株D型多杀性巴氏杆菌、1株E型多杀性巴氏杆菌、2株F型多杀性巴氏杆菌及大肠埃希菌、沙门菌、胸膜肺炎放线杆菌、支气管败血波氏菌各1株委托农业部兽医诊断中心、北京市动物疫病预防控制中心、天津市动物疫病预防控制中心、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、广西兽医研究所、北京市农林科学院畜牧兽医研究所、山东省农业科学院畜牧兽医研究所、湖北省农业科学院畜牧兽医研究所、青岛农业大学动物科技学院、华中农业大学动物医学院、四川农业大学动物医学院共11家科研院所采用标准中新增的病原鉴定中的分子生物学鉴定法—定种PCR鉴定方法和荚膜定型的多重PCR鉴定方法进行技术复核，各菌株均至少由2家单位对其进行鉴定。11家单位出具的复核结果表明，定种PCR鉴定方法和荚膜定型的多重PCR鉴定方法均具备良好的特异性及稳定的重复性，可实现猪巴氏杆菌病病原的快速鉴定，满足猪巴氏杆菌病快速诊断的需求。

5 修订猪巴氏杆菌病诊断技术的主要内容

“范围”部分增述了多杀性巴氏杆菌定种的PCR鉴定方法和荚膜定型的多重PCR鉴定方法的适用性。“临床诊断”及“病理剖检”部分参照《兽医传染病学》(陈溥言主编)[12]中相关描述进行了修改。 “病原分离”部分删除了不适宜多杀性巴氏杆菌生长的麦康凯琼脂培养基，并将改良马丁琼脂培养基和马丁肉汤培养基改为更适宜多杀性巴氏杆菌生长的胰蛋白大豆琼脂培养基和胰蛋白大豆肉汤培养基。新增了定种PCR鉴定方法。“荚膜血清型鉴定”部分在原有的间接血凝试验( Carter氏荚膜定型法)的基础上又新增了另一种选择—多重PCR荚膜定型法，并对多杀性巴氏杆菌间接血凝试验程序表也进行了完善。“附录A”部分增添了胰蛋白大豆琼脂培养基(TSA)和胰蛋白大豆肉汤培养基(TSB)的制备方法。

6 展望

猪巴氏杆菌病又称猪肺疫，是由多杀性巴氏杆菌引起的一种以败血症和炎性出血为特征的猪传染病。大小猪均有易染性，小猪和中猪发病率较高。一年四季都可发生，特别是春秋两季更易发生，此病多发生于其他传染病之后，也可呈地方流行性发生。最急性型死亡率可达100%，急性型和慢性型死亡率可达60%，造成巨大经济损失，严重危害我国养猪业的发展。

运用新增的多杀性巴氏杆菌定种PCR方法对临床病例诊断时，与传统诊断方法相比，可提前7～10天确诊，有利于及早对患病猪进行隔离治疗，对健康猪群采取预防措施，有效降低患病猪的死亡率和发病率，缩短患病猪的病程和提高治愈率及饲料报酬，从而降低由多杀性巴氏杆菌病造成的经济损失。 本标准的修订可实现猪巴氏杆菌病病原的快速鉴定，满足猪巴氏杆菌病快速诊断的需求，对提高猪群的生产性能有积极作用。

在多杀性巴氏杆菌种的鉴定时，新增的定种PCR方法比传统的定种方法(如生理生化)更加准确快捷，仅依靠定种PCR结果就可以确诊病原，另外该方法较为方便开展该病的大规模流行病学调查。在多杀性巴氏杆菌荚膜定型时，新增的荚膜定型多重PCR方法试验时间短、操作简便，不用制备荚膜A型、B型、D型定型血清和被检多杀性巴氏杆菌荚膜抗原致敏红细胞，荚膜定型多重PCR试验所用的试剂均已商品化，易于获取，减少了检验者的人员误差。从提升诊断技术水平上讲，该标准也将发挥积极的促进作用，将分子生物学技术添加进原有标准中，缩短诊断周期，使诊断结果更加准确，有利于临床兽医工作者更早做出正确诊断，降低疾病损失。

参考文献：

[1] Townsend K M, Boyce J D, Chung J Y,etal. Genetic organization ofPasteurellamultocidacap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system[J]. J Clin Microbiol,2001, 39:924-929.

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[6] 高明燕，徐步，赵宝华，等. 多杀性巴氏杆菌检测、鉴定和分型研究进展[J]. 动物医学进展,2010,31(1):67-72.

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[9] 马文戈，于力. 牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定[J]. 中国预防兽医学报,2008,30(10):747-754.

[10] 张媛，魏财文，李建，等. 多重PCR在多杀性巴氏杆菌荚膜定型中的应用[J]. 中国兽医科学,2014,44(12):1 211-1 216.

[11] NY/T 564-2016. 猪巴氏杆菌病诊断技术[S].

[12] 陈溥言.兽医传染病学[M].5版.北京:中国农业出版社,2013.