细胞自噬在结核分枝杆菌感染中的作用

魏凡华 ， 许立华

(宁夏大学农学院 , 宁夏 银川 750021)

结核病是严重危害人类健康的一种感染性疾病，其主要病原体是抗酸性棒状结核分枝杆菌。1998年世界卫生组织(WHO)的统计结果表明，全世界约有1/3的人口受到结核杆菌的潜在感染[1]。尽管只有一小部分的潜伏感染人口会发展成结核病，这仍然意味着每年将增加800万结核病例和导致大约150万结核病人死亡。结核病是死亡率排在第二的传染性疾病。我国卫生部对结核病的流行病学调查发现，我国结核病的疫情相当严峻，并且呈上升趋势。而且，在新发现的结核病病例中，存在着多重耐药(Multidrug-resistant，MDR)和广泛耐药(Extensively drug-resistant，XDR)现象。

自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的胞质组分或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体或液泡中进行降解并得以循环利用。根据细胞物质运送到溶酶体内方式的不同，自噬可分为巨自噬、分子伴侣介导的自噬和小自噬。通常所说的自噬指的是巨自噬，依赖于自噬相关基因(Autophagy-related gene，Atg)的激活。自噬过程可以分为3个阶段：(1)启动阶段：自噬小泡膜开始形成，起始阶段的关键分子是mTOR激酶，可以感受细胞内氨基酸和ATP的数量从而控制细胞的自噬活性；(2)延长阶段:自噬小泡膜弯曲、延伸，形成吞噬体膜以包裹吞噬的成分。泛素样结合系统参与自噬小泡膜的延伸，目前发现有两个泛素样结合系统：Apg12/Apg5系统和Apg8及其靶向分子磷脂酰乙醇胺；(3)成熟阶段：包括晚期内涵体与溶酶体的融合及自噬体的降解。巨自噬与结核分枝杆菌的感染尤为密切。本文将重点对自噬在抵御结核分枝杆菌感染中的当前研究状况进行综述。

1 细胞自噬与抵御病原体感染

多种因素的刺激均可以诱导细胞自噬的发生，例如低氧环境、氧化应激、病原微生物感染和药物处理。机体可以通过细胞自噬作用降解损伤的细胞器、蛋白沉积物和胞内病原微生物等，从而维持细胞自稳。自噬相关(ATG)蛋白在调节细胞自噬中起着重要的作用，包括自噬的启动、自噬小体和溶酶体的融合等。常见的ATG蛋白包括：(1))ULK激酶复合物，包括ULK1、ULK2和ATG13等，被AMP激酶(自噬的正调控因子)和 mTOR (雷帕霉素的药物靶点，自噬的负调控因子)所调控；(2)PI3K复合物，包括VPS34、ATG6 (也称为Beclin-1)、ATG14 (也称为Barkor)和VPS15蛋白，参与自噬小体的成核；(3)ATG9，自噬小体形成过程中提供脂质双层；(4)ATG12-ATG5-ATG16L1复合体；(5)泛素样微管相关蛋白1轻链3 (The ubiquitin-like microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)。ATG12-ATG5-ATG16L1复合体可以发挥E3 连接酶的作用，指导胞质型LC3的C末端与磷脂酰乙醇胺相结合，产生胞膜型LC3-II 形式，形成双层膜的自噬小体，引发自噬小体与溶酶体的融合，形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物。

自噬是细胞阻断病原体利用宿主细胞而生长繁殖的手段，是宿主细胞抵御病原体感染的重要机制。宿主细胞可以通过自噬抵御多种病原微生物的感染，包括细菌、真菌、原生动物和病毒等。宿主细胞的大分子或细胞膜被泛素或半乳凝集素所标记，进而被自噬接头蛋白所识别，例如P62、NBR1、泛素化自噬受体蛋白OPTN或CALCOCO2(Calcium binding and coiled-coil domain 2，CALCOCO2)等，最后在溶酶体中被降解。然而，部分细菌通过分泌效应分子调控自噬信号通路，逃脱自噬介导的降解[2]。

2 细胞自噬与抵御结核分枝杆菌感染

2.1 细胞自噬与结核分枝杆菌感染存在遗传相关性 研究发现，细胞自噬与结核分枝杆菌感染之间存在着遗传学上的相关性。全基因组关联研究(Genome-wide association study，GWAS)表明炎性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)和结核病之间存在着易感基因的遗传重叠。最先研究认为，ATG16L1和IRGM基因多态性和IBD的发生发展密切相关。进一步研究发现，IRGM基因多态性和结核分枝杆菌感染存在基因关联性。IRGM基因可以刺激已感染巨噬细胞中吞噬小体的成熟和细胞自噬，诱导结核分枝杆菌的清除。IRGM基因缺失的情况下，小鼠不能有效地清除体内的结核分枝杆菌[3]。在不存在25-羟胆钙化(甾)醇的条件下，维生素D受体的基因多态性和结核分枝杆菌感染的易感性存在遗传关联[4]。此外，TLR2基因多态性也是结核病发生发展的易感位点，TLR2激活后可以通过活化p38信号通路而诱导细胞自噬。

2.2 细胞自噬与天然免疫信号通路 细胞自噬是天然免疫应答的一个重要组成部分，但其活化的信号通路还不十分清楚[5]。已有研究表明，模式识别受体可以激活自噬的发生，通过TRAF6激活或稳定Beclin-1 和ULK1的水平[6]，诱导宿主天然免疫应答，克服结核分枝杆菌感染导致的吞噬小体成熟的静止。TLR2、TLR4和TLR9在识别结核分枝杆菌，刺激产生抗结核分枝杆菌的效应分子和细胞因子，以及诱导吞噬小体成熟、激活细胞自噬和杀灭病原菌中发挥重要的作用[7-8]。最近研究证实，TLR7也参与抗结核分枝杆菌感染，上调TLR7能够增加被感染细胞的存活和上调LC3-II的水平[9]。而且，TLR信号通路的一些其他关键分子也参与调节了细胞自噬的激活，例如MyD88、β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF)和MAPK激酶。研究发现，结核分枝杆菌的部分编码分子可以调控细胞自噬。结核分枝杆菌19 KDa的脂蛋白可以通过TLR2通路激活单核细胞和巨噬细胞中的自噬反应。EIS抗原蛋白可以介导细胞和NADPH氧化酶源的ROS生成[10]，上调IL-10水平和激活Akt/mTOR/p70S6K通路[11]，从而抑制宿主细胞自噬的发生。EIS蛋白还具有N-乙酰基转移酶的作用，可以引发双特异性磷酸酶DUSP16(Dual-specificity protein phosphatase 16，DUSP16)/MAPK磷酸酶7(MKP-7)55位Lys的乙酰化反应，由于DUSP16/MKP-7是JNK特异的磷酸化酶，因此抑制了JNK的磷酸化和炎性因子的产生[12]。此外，模式识别受体NOD2 可以通过受体相互作用丝苏氨酸激酶2(Receptor interacting protein kinase 2 ，RIPK2)和ULK1的激活，激活宿主细胞自噬[13]。结核分枝杆菌胞壁酰二肽可以作为NOD2的配基，通过RIPK-2、ATG5、ATG7和ATG16L1，形成吞噬小体[14]。肺泡巨噬细胞中NOD2的激活，诱导IRGM、LC3和ATG16L1基因的表达，促进宿主细胞自噬的发生，有助于下调结核分枝杆菌的毒力。体内动物实验结果表明，NOD2基因缺失小鼠在受到结核分枝杆菌MDP刺激后，NF-κB激活和IL-1β水平明显上调[15]，不能有效地募集ATG16L1蛋白和诱发宿主细胞自噬，这说明NOD2介导的自噬通路有助于杀灭病原菌和维持宿主免疫自稳。此外，胞内病原体DNA刺激产生的环化二核苷酸GMP-AMP(cGAMP)和细菌分泌的环鸟苷二磷酸(Cyclic-di-GMP 和Cyclic-di-AMP)也可以诱导宿主细胞自噬和ULK1激活[16]。抑制主要组织相容性复合体(MHC)的抗原递呈，也是结核分枝杆菌免疫逃避的重要机制[17]。由此可见，对于结核分枝杆菌的相关配基以及抗原蛋白调节宿主细胞自噬的认识，有助于研发用于控制和预防结核病的治疗药物和疫苗。

2.3 细胞自噬与细胞因子 诱导产生细胞因子是宿主抵御结核分枝杆菌感染的重要机制。研究已经证实，部分保护性细胞因子可以激活宿主细胞自噬，促进抗结核分枝杆菌免疫应答。Th1型细胞因子IFN-γ在激活自噬介导的结核分枝杆菌清除中发挥重要的作用，而Th2 型细胞因子IL-4和IL-13可以抑制IFN-γ依赖的自噬激活[18]。IL-4和 IL-13抑制IFN-γ介导细胞自噬的信号通路依赖于STAT6，而抑制饥饿诱导细胞自噬的信号通路依赖于Akt信号。IFN-γ增强了宿主细胞通过自噬反应对结核分枝杆菌的清除，这和诱导产生诱导型一氧化氮合成酶2、干扰素诱导的GTPase 家族LRG47等抗菌效应分子以及上调MHC II分子有关。TNF-α可以促进IFN-γ介导的抗菌应答和自噬反应[19]。其他一些细胞因子，例如IL-17，上调MAPK1/3信号通路，正调控宿主细胞的自噬反应[20]。

细胞因子的产生和自噬反应的激活是相互调控的，细胞因子可以调控自噬反应，同样地细胞自噬也可以调控细胞因子的水平。例如，细胞自噬可以上调TNF-α的表达和产生，下调部分细胞因子的转录、加工和分泌，包括IL-1α、IL-1β、I型干扰素和IL-18。自噬反应下调IL-1β的水平与促进pro-IL-1β降解和抑制AIM2 和 NLRP3炎性小体激活有关[21-22]。宿主细胞自噬反应防止了缺陷线粒体的积累，减少了ROS的产生和线粒体DNA(mtDNA)的释放。ROS可以激活NLRP3，mtDNA则激活AIM2，从而上调IL-1β的加工和分泌。IL-1α和IL-1β都有助于机体抵御结核分枝杆菌的感染，但是过度的IL-1α产生将会导致炎症和病理损害，例如Th17功能紊乱和肺部组织坏死[23]。

2.4 宿主细胞通过自噬反应抵御结核分枝杆菌的机制 宿主细胞通过自噬反应杀灭胞内结核分枝杆菌的机制与自噬溶酶体独特的降解作用和抗菌特性有关，这种降解作用和抗菌特性远强于普通的吞噬体。细胞自噬可以促进吞噬小体的进一步成熟，克服由于结核分枝杆菌感染导致的吞噬小体成熟受阻。吞噬小体也可以直接捕获一部分胞内结核分枝杆菌，发展成为具有降解功能的自噬溶酶体[24]。细胞自噬也可以促进抗结核分枝杆菌多肽(例如组织蛋白酶抑制剂等)和溶酶体的融合。此外，细胞自噬促进结核分枝杆菌蛋白的泛素化和靶向溶酶体的输送[25]，生成和输送新生抗菌肽[21, 26]。结核分枝杆菌感染转基因小鼠的体内试验表明，自噬反应可以有效保护机体病原菌感染、炎症应答、肺组织病理学和死亡率。Atg5fl/flLysM-Cre转基因小鼠髓系细胞中缺乏自噬相关基因，结核分枝杆菌Erdman株感染后，Atg5fl/flLysM-Cre转基因小鼠的细菌负载量和死亡率明显增加[24]。总之，生理学和免疫学因素刺激触发的细胞自噬激活均可以杀灭胞内感染的结核分枝杆菌。

3 细胞自噬与结核病治疗

不难看出，细胞自噬在抗结核分枝杆菌的宿主免疫应答中发挥重要的作用。结核分枝杆菌毒力蛋白通过阻断，自噬小体与溶酶体的融合，促进结核分枝杆菌的体内生长[27]。因此，细胞自噬的诱导剂有用于治疗结核病的潜力。已有研究表明，硝唑尼特可以有效抑制雷帕霉素靶蛋白的复合体1(Mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1)信号通路和强烈地诱导自噬反应[28]。硝唑尼特的良好治疗效果可能与直接杀灭复制和非复制的结核分枝杆菌，以及诱导吞噬细胞的自噬反应有关。采用5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(AICAR)处理结核分枝杆菌感染的巨噬细胞，能够强烈地激活自噬反应，有效地抑制胞内病原菌的生长[29]。这依赖于AMPK诱导的mTOR抑制和AMPK诱导的过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α，PPARGC1A)上调，从而导致转录因子CEBPB调控的自噬相关基因表达增加和自噬反应激活[29]。激活细胞自噬的免疫佐剂也可能用于结核病的治疗。IFN-γ可以激活细胞自噬，输送结核分枝杆菌到溶酶体。乳酸菌通过上调IFN-γ以及下调IL-4和IL-13，增强了单核吞噬细胞的体外杀菌能力[30]。此外，其他一些激活细胞自噬的药物也有用于治疗结核病的潜力，例如，作用于三磷酸肌醇通路的药物；抑制HMG-CoA还原酶的药物；RAC1-mTOR通路的抑制药物；包括结核分枝杆菌基因的DNA疫苗等。

4 展望

细胞自噬是宿主细胞自主进行的天然免疫防御机制，在抵御胞内结核分枝杆菌感染中具有重要的作用。在结核分枝杆菌感染中，免疫应答与细胞自噬存在着信号通路的交联，细胞因子与细胞自噬也存在着相互调控，因此，进一步解析细胞自噬通路在宿主抗结核分枝杆菌免疫应答中作用，对以自噬通路为靶标来预防和治疗结核分枝杆菌感染将具有深远的意义。

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