便携式葡萄糖传感器即时检测非葡萄糖目标物的研究进展

黄浩然 ， 窦文超 ， 赵广英

(浙江工商大学食品与生物工程学院 浙江省食品安全重点实验室 ， 浙江 杭州 310018)

电流型葡萄糖传感器包含多个种类，目前应用最多的是便携式葡萄糖传感器(personal glucose meter，PGM)，在快速、灵敏、准确、便携、经济和结果直观可读等方面具有突出优点[1]。近年来，PGM在检测非葡萄糖目标物方面引起国内外动物医学、医学、食品安全和环境等多领域研究人员的广泛关注且发展迅速，自Lu等(2011)[2]首报用PGM检测非葡萄糖目标物成功以来，各领域研究人员已解决了多种关键技术问题，成功研发了基于PGM的多类型检测系统，实现了对农残、兽残、食品有害添加物、重金属离子、致病微生物、病毒及真菌毒素的快速检测。本文将从检测系统的构建、指示信号的产生、改善与放大和不同类型目标物的检测3方面进行论述，以期推动PGM在各检测领域的快速发展。

1 不同类型检测系统的构建

基于PGM的非葡萄糖检测体系有多种，如已见报道的DNA探针、免疫夹心法、核酸适配体技术、分子印迹技术等。

1.1 基于DNA探针的PGM即时检测 用DNA探针以核酸互补配对方式检测目标物，具有非常高的特异性和灵敏度，适合用于核酸片段或小分子的检测。Xu等(2015)[3]利用基于链置换反应的DNA等温扩增技术检测目标DNA，在聚合酶作用下，少量目标DNA也可以使磁性纳米粒子上的多条捕获DNA与酶标DNA链互补结合，起到放大信号的作用，提高了检测的灵敏度，检测限为5.0×10-3pM。Luo等(2015)[4]利用DNA探针与多巴胺分子特异性结合后释放部分DNA链的特性，构建了一种基于PGM即时检测多巴胺的方法。

1.2 基于夹心法的PGM即时检测 夹心法检测目标物包括双抗体夹心法和核酸适配体夹心法。Lu等(2012)[5]首次使用双抗体夹心法检测前列腺特异抗原。Sun等(2014)[6]用反胶束法将葡糖淀粉酶封装在纳米金团簇内，在96孔板表面和纳米金团簇表面分别修饰凝血酶适配体，从而与被测物形成夹心结构。Wang等(2015)[7]用单克隆抗体捕获，适配体标记的方式检测心脏生物标志物肌红蛋白，既提高了检测的特异性，又提高了灵敏度，检测限为50 pM。

2 指示信号的产生、改善与放大

改善和放大指示信号，能有效提高检测的灵敏度和准确性，是考量检测系统优劣的重要指标。

2.1 分解基质碳源产生葡萄糖 利用活细菌生长繁殖过程中分解基质中特定碳源产生的葡萄糖，在一定时间内检测培养体系中葡萄糖含量并计算浓度差值△C，依据预先做好的标准曲线，确定样品中的菌含量[8]。该方法中，细菌总数测定的准确性、对于致病菌定性定量检测的特异性等，通常取决于配套研制的具有严格选择性的培养基，只有特定菌种才能实现。该方法的最大优点是简便、准确、稳定，非常有实用价值，其不足在于研制成具有严格选择性的适用培养基较难。

2.2 酶促水解产生葡萄糖或包埋后释放葡萄糖 现有报道中多用酶促水解产生葡萄糖，用PGM检测其量的变化。常用的酶包括蔗糖酶、葡萄糖淀粉酶以及淀粉葡萄糖苷酶等，其中蔗糖酶最为常用，Gao等(2016)[9]设计了一种检测甲基转移酶的方法，在磁性纳米粒子表面修饰多条双链DNA，并通过亲和素-生物素特异性结合蔗糖酶，由于未甲基化的双链DNA会被限制性内切酶HpaⅡ切断并释放蔗糖酶，因此葡萄糖信号较低则说明样品中存在甲基转移酶。近年来有研究者引入脂质体作为媒介，如利用脂质体包埋葡萄糖分子，用以检测黄曲霉毒素[10]。Xue等(2017)[11]包被葡萄糖淀粉酶，再在脂质体表面修饰DNA探针，当甲基转移酶存在时，限制性内切酶DpnⅠ会特异性地切断甲基化DNA链，释放脂质体囊泡，最后使囊泡破裂水解淀粉，检测限可以达到0.002 U/L。利用脂质体作为媒介可以放大信号、降低检测限，但是由于其制作成本较高、难度较大，欲作为一种通用方法得到普及较难。

3 对不同类型目标物的检测

3.1 对兽药残留的检测 滥用兽药导致的有害物质残留对人体健康和畜牧业发展都有很大危害，即时检测氯霉素、莱克多巴胺等兽药残留有助于进一步降低动物源性食品的安全风险。

Chen等(2015)[12]以磁性纳米粒子为载体，用分子印迹技术在纳米粒子表面留下空隙，实现特异性检测氯霉素分子。Gan等(2014)[13]在磁性纳米粒子表面修饰β-环状糊精(简称β-CD)，β-CD可与莱克多巴胺上的苯环形成包结复合物，再在Envision试剂的聚糊精胺骨架表面修饰大量蔗糖酶用于信号放大，使最低检测限达到0.34 ng/mL，且检测时间远低于传统的色谱法和ELISA法。

3.2 饲料中有毒有害物质的检测 饲料作为影响动物源性食品安全的源头物质，加强监管、完善即时检测方法具有重要意义。基于PGM检测系统可以实现对饲料中有毒有害污染物包括重金属离子、黄曲霉毒素和三聚氰胺等的即时检测。Lu等(2013)[14]利用铅离子会使特定DNA链断裂的特性，设计以磁性纳米粒子为载体的检测方法，对铅离子检测限为75 nM。Zhang等(2015)[15]设计在96孔板表面修饰链霉亲和素，再连接基板链和催化链，当铅离子存在时，基板链断裂并连接互补DNA链，从而实现对铅离子的检测，该方法检测限可低至1 pM。

汞也是饲料的主要污染因素之一，在人体内富集会造成不可逆的DNA损伤和中枢神经损伤。有研究表明，汞离子可通过N-Hg键形成胸腺嘧啶-汞-胸腺嘧啶错配的特殊结构，其强度高于氢键。唐点平课题组利用这一特殊结构，分别以96孔板和金电极为载体发表了两篇PGM即时检测汞离子的文章。一是在DNA链的一端连接纳米金包被的蔗糖酶，用于信号输出，对汞的检测限为10 pM[16]。二是用同样的方法捕获汞离子，但将载体换成了金电极，用于信号输出的物质改为纳米金修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物，增大了比表面积，因此能修饰更多蔗糖酶，使输出信号更强，检测限进一步降低到了4.2 pM[17]。Fang等(2016)[18]利用重金属离子对微生物葡萄糖消耗的抑制作用，设计了一套检测多种重金属的方法，更加经济、简便。

Tang等(2016)[10]报以96孔板为载体，以免疫夹心法检测黄曲霉毒素，在标记抗体一端连接封装有葡萄糖分子的脂质体，最后用表面活性剂释放葡萄糖产生信号。另外，清华大学与美国伊利诺伊大学合作开发了一种PGM即时检测三聚氰胺的方法[19]。研究人员将BDNA与酶标DNA一起与三聚氰胺适配体互补结合，并巧妙地利用了三聚氰胺与其适配体结合时的特性，即在三聚氰胺存在时，适配体会折叠成特殊的形状，从而释放出酶标DNA。该方法在缓冲液中的检测限为41.1 μg/mL，在牛奶样品中为67.5 μg/mL，均接近美国标准。

3.3 对病原微生物的检测 病原微生物检测在医学和动物医学领域都具有重要的研究价值，完善病原微生物即时检测方法有助于提高治疗效率、减少经济损失。Joo等(2013)[20]利用双抗体夹心法结合PGM，在标记抗体一端修饰蔗糖酶，用以检测沙门菌，相较于传统的ELISA法，灵敏性和准确度都有所提升，检测限为10 CFU/mL。Ren等(2015)[21]通过静电吸附作用，设计了一种检测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的方法。即在磁性纳米粒子表面包硅，处理后得到一种可以靠静电吸附酶和微生物的纳米粒子，因大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表面带有较强的负电荷，纳米粒子会紧紧吸附在菌体表面，从而释放原本吸附的葡萄糖淀粉酶，再通过酶促反应释放信号。本研究室自2013年开始进行PGM即时检测病原微生物研究至今，完成了多项检测研究[8,22]。解决了多个关键技术问题，实现了对大肠埃希菌计数、菌落总数测定、嗜热脂肪芽孢杆菌定性和定量检测，弧菌属细菌和克洛诺阪崎肠杆菌的快速检测等，在致病微生物检测方面具有显著优势。

3.4 对病毒的检测 血糖仪用于病毒的即时检测也有报道，Lu等(2012)[23]利用核酸的特异性杂交，将捕获探针修饰在磁性纳米粒子上，与酶标探针一同形成乙肝核酸的互补链，同时，改变片段上的一个碱基，设计多个错配的核酸片段以验证该方法的特异性。结果显示，该方法较好地实现了在生物样品中对乙肝核酸序列的选择性检测，检测限为40 pM。Wang(2014)[24]等结合微流控芯片，利用其高通量、多通道的特性，设计检测3种乙肝病毒核酸，通过亲合素-生物素在通道表面修饰大量捕获DNA，提高了检测的灵敏度，检测限低至10 pM，且可多目标同时检测。

4 展望

目前，PGM即时检测的拓展研究展现出了令人欣喜的成果，并显示出了很大的应用潜力。用该方法结合其他新技术和新材料可进一步提高灵敏度和准确性。从已有的研究成果来看，该方法在动物源性食品安全、饲料安全检测等方面具有显著优势。更重要的是，该法所需时间短，检测价格低廉，灵敏度高，且对设备和人员要求低，适于制成试剂盒供养殖户和商家使用，同时也为欠发达地区的动物医学检测提供了新的方法。但其也存在不足之处，如市售血糖仪种类繁多，不同品牌的血糖仪对同一样品的定量检测结果有时会有较大差异，因此使用不同品牌仪器的实验室需各自预先建立自己的标准曲线。总之，基于PGM的即时检测系统在检测非葡萄糖目标物时具有广阔的应用前景，相信在不久的将来，该方法能在动物医学、医学和食品安全等领域取得长足进展。

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